酶切连接二。DNA克隆的过程导入宿主细胞筛选扩增三。工具酶。1。限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）:识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割DNA双链 结构的一类内切酶。根据酶的结构，所需要辅助因子及裂解DNA的方式不同，分为三类。I 类：由三种不同的亚基组成，需要Mg+, SAM和ATP为辅助因子，这类酶识别部位复杂，特异性差。 II 类：由三种亚基组成，需要Mg+，ATP为辅助因子。III 类：由一种亚基组成，其活性仅需要Mg+作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识别的部位范围内。根据识别部位核苷酸组成的特点，可将识别部位分为四种类型。（1）回文结构：比如：EcoRI5- G AATTC 3 3- CTTAA G 5KpnI5- GGTAC C 3 3- C CATGG 5MspI5- CC GG 3 3- GG CC 5(2) 间断回文结构:Bgl I5- GCCNNNN NGGC 3 3- CGGN NNNNCCG 5（3） 简并序列Ava II5-G GA/TCC-3 3-CCT/AG G-5(4) 非回文序列Mbo II5-GAAGAN8 3 3-CTTCTN7 -5同识异切酶，比如 Hpa II, MspI- CCGG -GGCC -所切割的DNA具有相同的粘性末端的一类酶：比如，SalI和XhoISalI5- G TCGAC 3 3 CAGCT G 5Xho I 5- C TCGAG 3 3- G AGCT C 5二。修饰酶1。DNA聚合酶I：活性包括(1)53 DNA聚合作用(2) 35外切酶活性(3) 53外切酶活性Klenow片段：DNA聚合酶I C 端的大片段，活性包括(1) 53 DNA聚合作用(2) 35外切酶活性用途：(1) 标记DNA的3末端 (2) 修饰突出的3或5末端以产生平端 (3) 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记 (4) 克隆cDNA时合成第二链 (5) 双脱氧法DNA测序2。T4 DNA聚合酶：活性：(1) DNA聚合酶活性 (2) 35端外切酶活性 （单链或双链） (3) 缺少53端外切酶活性(1) 放射性标记DNA片段的3末端 (2) 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3末端，即所谓的“ 置换合成” (3) 变双链DNA的粘性末端成平端用途：3。T7 DNA聚合酶（1） 天然T7 DNA聚合酶 （T7基因5蛋白/硫氧还原蛋白复合物）（1）DNA聚合酶活性很强 （2）35末端外切酶活性（单链或双链）用途：A: 延伸长的DNA模板 B: 用于定点诱变中互补链的合成 C: 应用于3末端的标记 D: 将双链DNA的粘性末端 （5或3末端突出）转变为平端(2) 经修饰的T7 DNA聚合酶：其35外切酶活性可选择性的降低， 或通过基因工程改造使之完全失活，而保留了DNA聚合酶活性。用途：(1) 用于DNA测序(2) 用于标记5末端突出的DNA的3末端。由于它会在3端留下一个额外的碱基，因此不能应用于将粘性DNA末端转变成平端。4。 反转录酶来源：1.禽类成髓细胞瘤病毒 （avian myoblastosis virus,AMV） 2.莫洛尼鼠白血病病毒 （Moloney murine leukemia virus,MMLV）活性：1.RNA指导的DNA聚合酶活性 2.DNA指导的DNA聚合酶活性（不具35外切酶活性 ） 3.具有RNaseH活性,即从5或3端连续降解RNA与DNA杂种双链内的RNA链部分。用途：(1)将真核基因的mRNA转录成cDNA文库 (2)对具有5突出端DNA片段的3端进行填补和标记 (3)代替Klenow酶用于DNA序列测定5.碱性磷酸酶 （Alkaline phosphatase）活性：催化水解DNA，RNA，dNTP和NTP上的5磷酸残基。用途： (1) 去除DNA和RNA的5端磷酸基，而后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用 -32P ATP在 5端进行标记，以便进行序列分析。 (2) 除去载体DNA5磷酸基，可以防止自身环化，提高重组DNA效率。6。T4多聚核苷激酶活性：(1) 催化ATP的位磷酸转移到DNA或RNA的5端羟基（活性高） (2) 将RNA或DNA5端的磷酸基转移给ADP生成ATP, 而5端又成为羟基。用途：（1）单双链核酸分子5末端的同位素标记。 （2）对单双链核酸分子5末端磷酸化，以利于重组DNA分子之间的连接。7。DNA连接酶活性：催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成。（1）T4 DNA连接酶：此酶是唯一在正常条件下，有效连接平端DNA的连接酶。粘性 末端的连接通常在1215度进行，平端的连接通常在室温 （低于30度），所需酶量是粘端连接的10100倍。（2）大肠杆菌DNA连接酶：活性：修复双链DNA中的单链切口，并可催化互补粘性末端的连接。在正常反应条件下，它不能连接平端。8。T4 RNA连接酶：活性：在ATP存在下，催化单链DNA或RNA的5端磷酸与单链DNA或RNA的3端羟基共价连接。用途： （1）RNA 3末端的放射性标记。 （2）寡聚的DNA和RNA分子环化 （3）增加T4 DNA连接酶的平端连接活性9。 外切核酸酶：9.1 外切核酸酶VII活性：从单链DNA 5和3末端进行外切消化的活性，产生小的寡核苷酸片段。用途： （1）基因组DNA中内含子的位置作图。（2）切除通过poly(dAdT)加尾插入到质粒载体中的DNA片段。9.2 双链5-3末端外切核酸酶（1） 噬菌体外切核酸酶活性：催化从双链DNA5带磷酸基因的末端开始的持续水 解， 释放5核苷单磷酸，但不降解5为羟基的末端。应用：在应用双脱氧法测序时，将双链DNA转变为单链DNA。（2）T7基因6外切核酸酶活性：催化双链DNA的5末端的依次水解，生成5核苷单磷酸 。它的作用持续性较低，对5端为磷酸基因或羟基的DNA链都 能作用。应用：与噬菌体外切酶活性相比，此酶的优势在于它从5末端 的降解均匀且可控制，此外，它也可降解5为羟基的末端。9.3 双链3-5外切核酸酶。外切核酸酶III活性: 催化双链DNA从3羟基末端开始水解，释放核苷单磷酸。它的 外切酶活性是非持续的，因而是用在双链DNA中产生均匀的单链区 的理想工具酶，水解的速度受核苷酸组成的影响（CA-TG）应用（1）与Klenow酶联用，制备链特异性探针，类似于利用T4 DNA 聚合酶活性进行交换合成反应。 (2) 制备单链模板用于双脱氧测序。10。内切核酸酶10.1 S1核酸酶活性：高度特异性的单链内切酶，在尿素，SDS和甲酰胺中稳定。应用: （1）分析抗S1核酸酶降解的RNA:DNA杂合体以定位RNA转录物的5和3末端。 （2）通过消化成熟RNA分子与32P 标记的基因组DNA杂交形成的杂合体，确定内含子的位置。（3）消化在以反转录酶合成cDNA时形成的发卡结构。（4）去掉DNA 片段的单链突出末端，产生用于连接的平端。10.2 脱氧核糖核酸酶I （DNase I）活性：Dnase 酶I 是需二价阳离子的内切酶，降解双链DNA 产生带3羟基 的寡核苷酸。在Mg2+存在下，在双链DNA上产生缺口，在Mn2+存在下， 断裂双链DNA。应用: (1) 切口平移标记探针。(2) 用于足文（Footprint）实验。(3) 在Mn2+存在时裂解双链DNA，用于随机克隆。11. 核糖核酸酶11.1 核糖核酸酶 A (RNase A)活性：在C 和U 残基后特异性水解RNA的内切酶。11.2 核糖核酸酶 H活性：特异性的水解RNA:DNA杂交体中RNA的磷酸二酯键。 不降解单链或双链的DNA或RNA.113 核糖核酸酶III（RNaseIII）活性：水解双链RNA应用：制备 12末端转移酶（Terminal Transferase）活性：末端转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化 脱氧核苷酸结合到DNA分子的3羟基端。带有突出、凹 陷或平末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物13T7 RNA聚合酶活性：体外合成RNA应用：1，放射标记RNA探针2，合成RNA，用于体外翻译3，合成双链RNA，用于RNA干涉实验14Poly(A)聚合酶活性：加AMP到的末端。也可加 （）和（）到末端，但效率更低应用：，加（）到的末端，末端标记1,插入片断两端的酶切位点与载体完全匹配GGTACCCTCGAG CCATGGGAGCTCKpnIXhoICATGGC CGGTACC GAGCTTCGAG CGGTACCTCGAGC载体2，一端匹配，另一端不匹配先用不匹配一端限制性酶切，补平成为平末端，然后再用 匹配一端酶切GCTAGCCGATCGCTCGAGGAGCTCNheIXhoI先用NheI切割CTAGCGGAGCTCCTCGAG用T4DNA聚合酶或 Klenow酶补平CTAGCGATCGCTCGAGGAGCTCdNTP XhoI切割GATCGCTAGCCGAGCTTCGAG CCG载体3，两端都不匹配（1）平末端连接CGATCGGCTAGCNheI CATATG GTATACNdeI用NdeI和NheI切割，回 收目的片断CTAGCGCAGTAT用T4DNA聚合酶补平dNTP CTAGCGATCGGTATCATACpGCGp用碱性磷酸酶去除 5端磷酸根GCCG（2）用末端转移酶加入多聚核苷酸GATCGCTAGCCATA GTAT末端转移酶dATP CATA GTATCTAGC GATCGAAAA AAAAGpTTTTCGTTTTCp（3）在目的片断两端加入接头CTAGC GATCGCATA GTATKpnICATACTAGC GATCGCAGGTTATTCCGCATGGTCCAATAAGGCCGGAATAACCTGGTAC GCCTTATTGGACKpnIGTATGGTACCCGGTAC二核酸探针的标记（一），末端标记1，单末端标记GCTAGCCGATCGCATATGGTATACNheI NdeI 用NheI切割GCGATCCTAGCGGTATACCATATGKlenow酶dNTP(- 32P-dNTP) C TAGCGp*ATCGCGA TCGCTp*AGCATATGGTATAC2,双末端标记CTAGC GGTATCAKlenow酶dNTP(- 32P-dNTP) C TAGC Gp*ATCGGTA TCATp*A 3,利用T4核苷酸激酶进行末端标记P P碱性磷酸酶OH OHT4核苷酸激酶-32p-ATP *P P*应用：DNaseI Footprint实验和Gelshift实验2，随机引物标记变性（加热）随机引物 XX XX XXX XXXX XX XXKlenow酶 dNTP(-32p-dNTP) 3,缺口平移标记DNaseIKlenow酶 dNTP(-32p-dNTP) X X XX X XXXXX应用：Northern和Southern 杂交三，cDNA 5末端扩增（5-Race）第一种方法：第二种方法第三种方法四，特异基因SiRNA的体外制备 RNaseIII五，micro-RNA的克隆OHPPoly(A)聚合酶dATPPAAAAAAT4 RNA ligaseOH RNAAAAAAA逆转录酶AAAAAATTTTTTTTTTTTcDNAPCR和 克隆上游引物下游引物六，DNA调节序列缺失体的构建七，点突变八，基因表