（feiyun39126.com)基因工程基因工程首都师范大首都师范大 生命科学学院生命科学学院 祁晓廷祁晓廷（qixiaotingcnu.edu.cn; qxt-163163.com）现代生物技术是解决人类面临的困境的有效途径基因工程的地位发酵工程细胞工程酶工程蛋白质工程基因工程常用生物技术举例 干细胞技术：恩同再造，无论换器官还是重生。 基因治疗：遗传物质的局部改变，亟待提高安全性。 哺乳动物体细胞克隆技术：开启了一个人类无法预知的克隆人的大门，是福是祸？ 全基因组测序：遗传天书编排才开始，读懂它尚需时日。 单克隆抗体技术：细胞全能性和细胞融合技术的完美结合。 .干细胞技术基因治疗技术1997年多利羊诞生使体细胞克隆哺乳动物成为可能多利和它的孩子人类基因组计划-人类基因的破解基因工程 - 现代生物学技术的核心，是基 因乾坤大转移和大融合的技术基因工程应用 微生物发酵：制备工业原料、食品添加剂 等 农业生产：动植物营养品质改良，提高抗 逆性 医药业：基因工程制药（抗生素、疫苗、 抗体等） 军事：生物武器 航天：提高生物耐缺氧、耐辐射等性状。植物基因工程植物基因工程ACC合成酶利用反义RNA技术，抑制乙烯合成的前体耐贮运对于番茄、草莓、香 蕉、苹果等果蔬最为重要这些东西最好也不要出现！微 生 物 基 因 工 程转基因植物番茄子叶分化 转基因番茄的移栽 田间生长与结实 ELISA检测转基因植株HBsAg活性 转基因番茄的PCR鉴定乙型肝炎表面抗原在转基因番茄中的表达体细胞核移植制备转基因动物的基本过程 胚胎干细胞的筛选和细胞移植 培育转基因动物的基本过程 转基因动物工具酶的总结克隆载体载体（Vector）的概念 添加复制起始位点、启动子和转录终止子 可以解决“单独”的外源基因在宿主细胞内不 能复制表达甚至被降解的“杯具” 。这一需 求催生了-载体。载体是携带外源基因在宿主细胞内完成的 复制甚至表达人工构建的DNA分子。载体的分类根据用途可以分为：克隆载体：在宿主细胞内高保真地大规模 复制。 测序载体：用于测定DNA序列。 表达载体：用于外源基因的表达。 尽管如此，“三合一”的载体目前经常用 。 根据来源不同可以分为： 质粒载体，病毒载体，人工染色体载体的基本条件1、能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制 。 2、具有合适的多种限制酶的单一切点。 3、具有适宜的筛选标记。 4、相对分子质量小，细胞内拷贝数要多。 5、在细胞内稳定性高，易分离纯化。载体结构多克隆位点，容 许外源基因插入 的合法位点宿主细胞能识别 的复制起始序列 ，如果含有两种 以上复制起始位 点，则为穿梭载 体筛选标记：抗生素分解基因 （Amp, Km等）、报告基因 （GUS, GFP, LUC,LacZ） 。这些基因多为组成型启动 子控制，恒定表达。启动子（宿主细 胞能识别的启动 子）终止子（转录终 止序列，多来自 宿主细胞病毒和 细菌）体外重组 重组DNA向宿主细胞导入Recombinant DNA重组重组是通过T4 DNA连接酶将目的DNA片段插入 到载体相应位点的DNA重组过程。通过优化连接 参数可以获得高的连接效果。具体如下：1. 插入片段摩尔数要多于载体摩尔数（3-10倍）；2. 平末端连接采用低温（4-8度过夜），而黏性末 端在室温下连接几小时或16度连接过夜。3. 连接体系一般为10-20微升，体积过大过小会影响 连接效率。 4.可以用T4 RNA 连接酶连接单链的DNA 分子。体外重组线路图导入重组体主要方法 物理学方法：微注射技术、基因枪技术、电转 化法（电穿孔术）、超声波化学方法：CaCl2低渗转化大肠杆菌、脂质体介 导法、PEG介导生物媒介方法： 病毒介导法、农杆菌介导转基 因方法转化原理负对照 实验组 正对照蓝白筛选结果一.根癌农杆菌介导转化植物的 方法1. 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens) 的一般性质：冠瘿病 Ti质粒（Tumor inducing plasmid) T-DNA (Tramsferred DNA)区 Vir区 * 冠瘿瘤的特点：激素自主性 冠瘿碱幻灯片5 无正常分化能力* 农杆菌与Ti质粒的类型：章鱼碱型（octopine type） 胭脂碱型（nopaline type） 农杆碱型（agropine type）* 冠瘿碱可以分为四类：章鱼碱族 胭脂碱族 甘露碱族 农杆素Octopine Vir 基因的基本结构与功能A: a.中间载体必须有T-DNA的同源序列，还有pBR的序列，进入农杆菌后高频同源重组 b.要有细菌选择标记基因，便于筛选共整合质粒 c.阳性的这选择标记基因 d.单一的限制内切酶切点，多克隆位点 e.无Ti质粒的边界序列 f.要有bom位点序列，可以在不同细菌细胞间转移B.二元载体系统的中间载体特点：a.无同源序列 b.有LB和RB c.无cell EI复制点T-DNA的整个 转化 过程缺失启动子-GUS表达载体转化烟草对照 抗性芽（Km:100ug/ml） 生根的转基因烟草苗（Km:100ug/ml） 转化烟草土培苗 开花的土培苗电转化法（electrotransfortion） 也称电穿孔术（electroporation）,是利用高压 脉冲瞬时放电，使电场中的细胞膜穿孔，位于溶 液中的外源基因得以进入细胞。影响转化率的因 素很多，如：电场强度、电脉冲的长度、DNA的 构象和浓度、培养液的离子成分等，需摸索反应 条件，优化各项参数。当电场强度和脉冲长度以 一定方式组合而导致5070细胞死亡时，转 化的水平达到最高。特点：无受体细胞特异性，动、植物细胞，原核 细胞均可；转化率不稳定，需摸索确定转化条件 ；具有成套专用设备。示意电激转化微注射技术（microinjection） 用微吸管吸入供体DNA溶液，在 显微镜下准确插入受体细胞核中， 并将DNA注射进去。特点：多用于动物细胞；注射过程慢， 技术要求高；有成套专用设备。DNA显微注射示意图 图示微注射转化的应用基因枪技术（geneblaster technique） 利用一个高速推动力，加速重金属粒 子运动，使附着在重金属粒子上的外源 DNA随同重金属粒子一起射入靶细胞或组 织内。一般把DNA包被在金粒或钨粒上， 用弹药枪（化学推进剂为动力）和电子枪 （以放电为动力）为工具将粒子向受体细 胞轰击。 特点：无宿主特异性；能直接向细胞器中输入 DNA；转化有壁的植物细胞有效；已有多种类型 基因枪可供选用，还在不断改进和发展。脂质体介导法 （liposome mediated gene transfer） 脂质体（liposome 人工膜泡）是由脂质 双分子层组成的环形封闭囊泡，无毒、无 免疫原性。在体外，脂质体作为基因载体 可将基因转化到细菌、真菌、植物原生质 体和动物细胞。利用脂质体导入基因，一 般都要将DNA或RNA包囊于脂质体内，然 后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合 导入细胞。图示脂质体介导的转化筛选概述筛选是从众多转化子中鉴定出含有目 的DNA片段的阳性克隆的过程。具体的 筛选程序为：DNA导入宿主细胞抗性筛选,报告基 因，营养缺陷筛选转化子蓝白筛选 重组转化子PCR筛选, 核酸分子杂交， 免疫选筛选阳性转化子测序阳性克 隆目的基因在哪里？获得目的基因的策略 1.化学直接合成（短基因，有钱）。 2.同源基因RT-PCR(或PCR)直接获得（全或部分序列已知） 。 3.文库筛选法(构建一个高质量的通用文库，采用核酸杂交 或免疫学筛选基因)。 4.从蛋白质出发的目的基因（蛋白质N端序列测序，随后 设计兼并引物联合RT-PCR）。 5.电子克隆（基于数据库，步步为营） 6.全基因组测序后预测（结合表达谱芯片可以高通量获得 表达发生变化的目的基因种类及其相对变化水平）。元件 基因元件组装成基因载体元件 多克隆位点克隆元件 衔接物或人工接头 引物 测序或PCR 探针 核酸分子杂交用化 学 合 成基因序列已知同源蛋白基因文库是将某一物种基因组DNA或cDNA以 克隆的方式（质粒或噬菌体）保存在大 肠杆菌中的方式。构建cDNA文库文库筛选免疫学筛选目的基因表达 目的基因在宿主细胞中的表达需具备如下几个特点：1.完整的表达框（启动子-核糖体结合位点-目的基因-标签-转录终止子） 。其中选择组成型、组织器官特异性、发育特异性和环境 诱导型启动子可以控制目的基因的特殊表达模式的需求。 原核表达需要用SD序列作为核糖体结合位点，而真核表达 需要有帽子位点即可。2. 控制表达水平，尽量减少蛋白产物对宿主细胞的正常生活 的干扰，产生分泌蛋白是一个不错的选择， 3.为了方便检测和纯化蛋白产物，可以表达一个融合标签（ HA、HISx6、C-Myc、 Flag、 GST等）。原核表达体系真核表达体系体外转录翻译体系表达载体SDS-PAGE of the lysate of uninduced and induced host bacteria E. coli BL21(DE3) containing the control expression vector or the recombinant expression vector and the purified recombinant protein. M protein marker, 1 lysate of E. coli BL21(DE3) containing pET-30a(+) without IPTG induction, 2 pET- 30a(+) with IPTG induction, 3 pET-30a(+)- CsTRIP-1 without IPTG induction, 4 pET-30a(+)- CsTRIP-1 with IPTG induction, 5the purified recombinant CsTRIP-1 protein