1道地药材五鹤续断基因组脱氧核糖核酸提取方法的改进【摘要】 目的为研究道地药材五鹤续断的遗传多样性、种类鉴定和基因指纹图谱的构建等提供基本保证。方法以中药材五鹤续断药源植物的鲜嫩叶片为材料，采用 CTAB 法并加以改进从中提取出基因组脱氧核糖核酸(DNA)，并检测其提取效果。结果使用改进的CTAB 法从鲜叶中提取五鹤续断的基因组 DNA 浓度较高，能满足PCR 反应的要求。结论自行改进的 CTAB 法提取道地药材五鹤续断基因组 DNA 效果较好。 【关键词】 五鹤续断; 脱氧核糖核酸(DNA)提取; CTAB 法; 改进道地药材是传统中医药文化中的精品，是在特定产区的外界环境和产区内该物种的地方种群遗传性状等综合因素的作用下，形成的品质优、疗效佳的中药材1。道地药材与非道地药材是不同产区的生物品，药材品质存在差异，但两者的形态和组织构造差异往往不明显，难以运用传统方法准确鉴别药材道地性。随着分子生物学的发展，DNA 分子鉴定技术及方法已广泛运用于中药材道地性与非道地性的鉴定2。而 DNA 的分离纯化是 DNA 分子鉴定等分子生物学操作中的重要步骤，同样也是药用植物分子诊断技术中的关键环节。由于中药材中含有的小分子次生物质，如萜类、黄酮、香豆2素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与 DNA 结合，引起 DNA 降解或抑制酶的活性; 而广泛存在的多糖类由于与 DNA同属大分子化合物，在一般提取过程中很难完全去除。因此有必要不断摸索并建立不同条件下简单、快捷、高纯度的中药材基因组DNA 提取方法。本实验就是以道地药材五鹤续断的幼嫩叶片为试验材料，采用自行探索改良的 CTAB 法对五鹤续断基因组 DNA 进行了提取，得到了质量较高的五鹤续断基因组 DNA，为应用于五鹤续断的遗传多样性、种质鉴定和基因指纹图谱的构建等分子水平的研究提供了基本保证，也为其他道地药材在分子生物学水平方面的研究提供了一定的参考资料。1 材料与仪器1.1 材料五鹤续断叶片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断 GAP 研究及种植基地，经湖北民族学院医学院中药教研室袁成玉副教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于-80 冰箱备用。1.2 试剂 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 mol/L 乙酸钠，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，1 mol/L NaC1，氯仿/异戊醇 241，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，10%CTAB 溶液，1.5 x CTAB 提取液，CTAB 沉淀液，5 mol/L NaC1，1 mol/L 乙酸钠，10mg/ml 3RNaseA，高盐 TE(含 1 mol/L NaC1)，1TE 缓冲液，以上部分是用分析纯配制试剂;Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等，购自大连宝生物有限公司;十六烷基三甲基溴化锭(CTAB)为 Geneview 分装，购自北京鼎国生物技术有限责任公司;琼脂糖购自北京华美公司。1.3 仪器 SANYO 超低温冰箱，Eppendorf 低温高速离心机，Eppendorf 梯度 PCR 仪，BeckmanD/U530 紫外分光光度计，恒温水浴锅，DYY-10C 水平电泳仪，BIORAD 凝胶成像系统，研钵和研棒，移液器。2 方法2.1 基因组 DNA 的提取 DNA 提取以 CTAB 常规法3，4为基础。为了克服多酚、多糖等次生物质对 DNA 纯度的干扰，提高获得 DNA 的数量和质量，同时还受到条件的限制，本研究对其进行了改良：选取新鲜幼嫩的五鹤续断叶片，酒精消毒后快速放入超低温冰箱;在没有液氮的情况下，利用超低温冰箱的冷冻作用和暗视野效应，再用预冷的研钵和研棒快速粉碎五鹤续断叶片;不用饱和酚，增加一次氯仿/异戊醇的用量，避免残留蛋白质和酚等物质影响 DNA 的质量; 用 1 mol/L NaCl，除去多糖物质，同时可减轻DNA 的褐化。4改良后的 CTAB 法具体提取步骤如下：快速取出保存在超低温冰箱中的新鲜叶片 3 g，放入已预冷冻的研钵中，迅速研磨成粉末，移入 50 ml 离心管;然后加入 8 ml 的 CTAB 提取液(先预热到80)，充分混匀，65水浴中保温 60 min，其间每 20 min 反转摇匀 1 次，取出样品，冷却至室温 ;加入 4 ml 氯仿，混匀后，平放在震荡器上摇动 10 min 至抽提液与氯仿完全混合，室温下 4 000 r/min 离心 15 min;将上清液转移至另一离心管中;加入 1/10量的 10%CTAB 液，摇匀; 加入等体积的氯仿 /异戊醇(241)，震荡 15 min 至混匀，室温下 4 000 r/min 离心 5 min; 取上清液重复此步骤;取上清液，加入等量的沉淀液，摇匀，室温放置 10m in，然后 4 000 rmin 离心 10 min;取上清液加入 1 倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20静置 20 min 使沉淀生成，12 000 r/min 离心 5 min;弃上清液，加入 5 ml 高盐 TE(含 1 mol/L NaCl)和 5 l 10 mg/ml RNase A 在 55摇床中轻摇至完全溶解;加入 1/10体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2 倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀， -20静置 20 min，使沉淀凝聚，用玻璃棒钩出呈絮恕状的 DNA，在 70%乙醇中洗涤 23 次，最后去除乙醇将沉淀放置风干，加入300 l TE 缓冲液至完全溶解沉淀，再短暂离心。2.2 DNA 的检测用紫外分光光度法测定 DNA 260 nm 及280 nm 吸光值，然后根据 A 260/280 值判断 DNA 纯度并根据DNA 260 nm 检测其浓度。5用琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 样品：取 8 l DNA 样品在1.0%的琼脂糖凝胶 (含 0.5 l/ml 的 EB 溶液染色)中进行电泳分离，在紫外透射仪下检测 DNA 的纯度及降解情况。用琼脂糖凝胶电泳法检测 PCR 产物：取 8 l PCR 产物在 1.0%的琼脂糖凝胶(含 0.5 l/ml 的 EB 溶液染色)中进行电泳分离，在紫外透射仪下检测 PCR产物的扩增效果。3 结果与分析3.1 提取方法的凝胶检测和 PCR 反应检测分析从图 1 可以看出，基因组 DNA 浓度较高，呈现一条亮带，无降解，说明对五鹤续断鲜叶采用改进的 CTAB 法效果较好，能提取得到完整洁净的基因组 DNA。从图 2 可明显发现，用改进后的 8 个不同来源的基因组 DNA 为模板在五鹤续断 18S rRNA 基因的 PCR 扩增中均得到理想的带型。1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸丰 5.宣恩 6.鹤峰 7.巴东图 1 五鹤续断不同产地的样品 DNA 电泳图 1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸丰 5.宣恩 6.鹤峰 7.巴东图 2 不同产地的五鹤续断 18S rRNA 基因的 PCR 产物电泳图3.2 紫外分光光度计检测由表 1 可见，对于新鲜叶子采用改良 CTAB 法 260/280 值均在 1.802.00 之间。表明改良 CTAB 法6的除杂效果较好。由表 2 可以看出，改良 CTAB 法提取的基因组DNA 浓度高，与琼脂糖凝胶电泳( 图 1)检测的结果一致。表 1 五鹤续断不同产地的紫外分光光度计纯度检测结果表 2 五鹤续断不同产地的紫外分光光度计浓度检测结果4 结论道地中药材用分子生物学方法进行的道地性研究，是近年来发展起来的新的鉴定方法，它可弥补传统形态学和生化分类鉴定的一些不足1。常用于中药材鉴定的分子生物学方法有RFLP，RAPD，AFLP ，SSR ，ISSR ，DNA 序列分析以及基因芯片等技术512。本研究的方法就采用 DNA 序列分析的技术来进行道地药材五鹤续断的分子鉴定，为五鹤续断的道地性和分子系统发育关系提供基础性资料。而进行这项研究关键步骤之一就在于提取高浓度的基因组 DNA，可为后续实验提供高质量的目的基因，所以有必要探索五鹤续断基因组 DNA 提取的改进方法，为后续实验打下基础。五鹤续断植株应采集鲜嫩幼叶，此部位有丝分裂旺盛，DNA含量较高，是基因组 DNA 提取的理想部位。采集后应立即进行消毒，避免提取出其它生物的 DNA 对五鹤续断基因组 DNA 的污染。由于地域限制，再加上液氮运输不便，不易储存，故本实验运用超低温冰箱-80 的超低温冷冻中药材植株鲜嫩叶片具有与液氮类似效7应，同时还具有暗视野效应，较少了叶绿素含量，避免叶绿素对DNA 提取的影响，本实验结果证实此方法较为有效。已有研究发现13，14，五鹤续断等川续断富含多酚、多糖、蛋白质等复杂的初生及次生代谢产物，这些物质易与 DNA 不可逆地粘附在一起，从而抑制 DNA 聚合酶等多种酶的活性，明显影响后续实验。故在本实验中尝试不用饱和酚，增加一次氯仿/异戊醇的用量，尽量避免残留蛋白质和酚影响 DNA 的质量，同时还使用含 1 mol/L NaC1 的高盐 TE，减少多糖对 DNA 含量的影响。从实验结果来看达到了目的，取得了较好的效果，基因组 DNA 及 PCR 产物条带清晰无明显拖尾等现象。总之，由于不同植物或同一植物不同组织的结构及生化成分都不相同，而这些结构和成分上的差异对 DNA 的不同提取方法往往会造成不同程度的影响，导致不同提取方法所得 DNA 在纯度和产量上的差异。因此，在实际工作中，应自行根据试材的生化成分和材料保存时间、方法等来筛选或建立适当的提取方法。【参考文献】1 何辉余.道地药材的成因研究J.中国民族民间医药，2009，4：5.2 周佐斌，葛 刚.中药材道地性的 DNA 分子鉴定J. 江西科8学，2008，26(3)：507.3 Fang G，Hammar S，Grumet R.A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNAJ.Biofeedback and self Regulation，1992，13：52.4 Cheng F s，Brown S K，Weeden N F.A DNA extraction protocol from various tissues in woody speciesJ.Hort Science，1997 ，32(2) ： 921.5 郑传进，赵树进，赵振华，等 .基于 rDNA ITS 序列的何首乌 PCR-RFLP 分子鉴别 J.华南理工大学学报(自然科学版)，2009，37(6)：74.6 张阵阵，郭美丽，张军东，等.红花 RAPD 和 AFLP 分子标记技术多态性效率比较J.中草药，2007 ，38(3) ：449.7 周 晔，王润玲，唐 铖，等.RAPD 标记法鉴定中药黄精及长梗黄精的研究J.时珍国医国药，2007 ，18(9) ：2149.8 罗志勇，周 钢，周肆清，等.AFLP 法构建人参、西洋参9基因组 DNA 指纹图谱J.药学学报，2000，35(8)：626.9 Saha T，Roy C B，Nazzr M A.Microsatellite variability and its use in the characterization of cultivated clones of Hevea brasilienses J.Plant Breeding，2005，124 ：86.10 沈 颖，徐 程，万小凤，等.ISSR-PCR 在石斛种间鉴别中的应用J.中草药， 2005，36(3)：423.11 刘玉萍，曹 晖. 基因测序技术在中药质量研究中的应用(I)山东郓城猴头半夏基原的 DNA 测序鉴别 J.药物分析