实验十二、表达载体的构建及鉴定基因工程中使用的表达系统类型 一、基因来源：原核生物真核生物 二、原核表达系统1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。2、真核表达系统原核表达载体克隆载体:通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。 表达载体:除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位 点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核 糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面312个碱 基，该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号 、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列 。原核表达系统类型大肠杆菌表达系统遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大 规模培养产生大量的目的蛋白质。但大肠杆菌表达的蛋白质大多不分泌到细胞体外，如 要使蛋白分泌到细胞外，必需使目的基因带有信号肽。信 号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种 位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约1530个氨基酸的 序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过 细胞膜被分泌出来。 枯草杆菌表达系统真核表达系统类型酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫杆状病毒表达系统植物细胞表达系统。真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序 列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号 、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等筛选标记等。大肠杆菌表达系统融合型原核表达载体 非融合型(天然蛋白质）原核表达载体pGEMEX-1载体图谱（融合型）1. Gene10 reader peptide 260aa; 2. More than 50% cell peoteins, and 10mg/L of induced culturepET-5a载体图谱（非融合型）融合型原核表达载体表达融合蛋白有下列优点：(1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列 开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳 定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋 白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从 凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作 为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到 细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。非融合型(天然蛋白质）原核表达载体通常天然蛋白表达载体（非融合型表达载 体）都含有一个强的可调控的启动子和一 个有效的核糖体结合位点。大多数原核基因中都带有一个有效的核糖 体结合位点，对这些带有强核糖体结合位 点的原核基因，只须提供一个启动子；而对被表达的真核基因(或带有弱核糖体结 合位点的原陔基因)，就必须同时提供一个 强启动子和一个有效的核糖体结合位点。选择表达载体应考虑的因素(1). 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然蛋白，必须考虑如何将目的准确地与载体衔接。如果是融 合蛋白，载体是由一系列3种不同阅读框架的载体组成，当 用同一种限制酶切割载体并与目的DNA片段重组时，则可以 保证其中至少有一种融合蛋白的框架与之吻合. (2). 被表达的基因是原核基因还是真核基因。原核基因一般都 带有核糖体结合位点，只虑它是否带有强启动子。对真核 基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外， 考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真 核表达系统中表达等。 (3). 表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有信号 肽序列，故应选择带适当序列的载体。选择表达载体应考虑的因素(4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割 加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体序列间应有适当的切割识别序列。(5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才能被表达。三种不同阅读框架图例PinPoint Xa-1 图谱目的基因的表达产物检测A重组载体的构建：将目的DNA片段与表达载 体连接，产生阅读框架对应的融合. B转化：将重组后pGEMEX-1载体转化E.coli JMl09，然后涂布于含氨苄青霉素 (100g/m1) 的LB平板上，在37下培养过夜。筛选能在 平板上生长的转化子。 C转化子鉴定: 将转化子挑出后，小批量培养 ，抽提质粒进行酶切鉴定或者PCR鉴定，确证 克隆片段确为所需目的片段后，进行诱导表达 。 D诱导表达：将含有重组质粒的JM109接入5ml 含100ug/m1 Amp的LB培养基中培养过夜，第 二天取50ul培养液接种到另一5ml LB(内含 100ug/m1Amp)培养基的试管中培养至光密度 值OD600为0.5左右，加入IPTG终浓度至 lmmol/L，继续培养6-12小时，使基因表达。 表达产物的检测：诱导表达后的细胞经5000g离 心后，TE缓冲液悬浮后加入SDS-PAGE上样缓 冲液电泳检查或进行Western blot检测。 目的基因的表达产物检测重组载体的构建：将目的DNA片段与表达载体连接，产生阅读框架对应的 融合. 转化：将重组后pKK233-2载体转化E.coli JMl09，然后涂布于含氨苄青 霉素(100g/m1)的LB平板上，在37下培养过夜。筛选能在平板上生长 的转化子。 转化子鉴定: 将转化子挑出后，小批量培养，抽提质粒进行酶切鉴定或 者PCR鉴定，确证克隆片段确为所需目的片段后，进行诱导表达。 诱导表达：A. 将含有重组质粒的JM109接入5ml含100ug/m1 Amp的LB培养基中培养过夜 .B. 第二天取50ul培养液接种到另一5ml LB(内含100ug/m1Amp)培养基的试 管中培养至光密度值OD600为0.5左右，加入IPTG终浓度至lmmol/L.C. 继续培养6-12小时，使基因表达。 5. 表达产物的检测：A. 取1.0 ml诱导表达后的培养液,经10000rpm 离心3min, 去上清液。B. 细胞沉淀用100ul 1X SDS-PAGE上样缓冲液悬浮。C. 沸水浴处理3-5min.D. 10000rpm 离心3min,取上清液进行SDS-PAGE和Western blot检测。