基因查找，引物设计及Real-time PCR庄群川2013.11.18 Part one -如何查找基因序列、mRNA序列 Part two -引物设计 Part three-Real-time PCR 原理及应用 Part four(Discussing)-从发现到分析,再到应用解决（临床问题 ） Part one -如何查找基因序列、mRNAThe relationship of DNA,RNA,mRNA, cDNA, Protein遗传学中心法责:DNA-RNA-PROTEIN! mRNA逆转录成为CDNA总RNA包括tRNA,mRNA,snRNA,rRNA等 1.DNA是细胞核中的双螺旋结构脱氧核糖核酸链，储存着遗 传信息。DNA包括内含子，外显子。 2.由DNA转录出各种RNA，RNA是单链的核糖核酸链。 RNA包括mRNA，tRNA，rRNA，ncRNA。 (ncRNA是none coding RNA 的简称，包括miRNA snRNA ,snoRNA ,scRNA,tmRNA等。) 3.mRNA从DNA转录出来后还要剪切掉内含子才可用来翻译 蛋白质。 4.mRNA经反转录得到的DNA成为cDNA，因为cDNA没有内 含子，所以和最初转录出mRNA的DNA不一样。 NCBI(National Center for Biotechnology Information) http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/mRNAmRNA 同一个基因，可能存在不同的 isoforms,mRNA序列有所不同，若没有特 别要求，只需扩增到该基因的话，PCR引 物可以选择扩增几个不同序列的公共保守 区的序列。 Part two -引物设计 参考影响因子高的文献上的引物序列或好 的网站上的（注意种属！） 自行引物设计（软件）普通PCRReal-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法） 普通PCR设计软件 Real-time PCR设计软件 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公 司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂 交探针的设计、评估的软件，其主要界面 分为序列编辑窗口（Genetank），引物设 计窗口（Primer Design），酶切分析窗口 （Restriction Sites）和纹基分析窗口（ Motif），这里我们主要介绍其引物设计功 能 。 打开程序首先进入的是序列编辑参看这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引 物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另 外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等 。 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起 始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻 界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的 不利结构。 PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构在左下的两排按钮可以显示发现 了哪些二级结构而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构除了 二级结构图框里也显示二级结构的自由能数值G 单位kcal/mol Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计 用于定点突变的引物或分析一条已有引物 序列。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活 用以将引物序列转化为反向互补或反向互 补形式您也可以手工键入引物序列一旦引 物被编辑发生变化Analyze 按钮就可以使 用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引 物。 Automatic Search 自动搜索 参考影响因子高的文献上的引物序列或好 的网站上的（注意种属！） 自行引物设计（软件）普通PCRReal-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法） Real-time PCRReal time PCR 使用SYBR Dye 的话，对PCR 产物的特异性要求非常高 。非特异产物主要是引物二聚体，它的多少可能决定了本实验的检测灵敏 度。熔点曲线和电泳可以检测引物二聚体。 SYBR 与所有dsDNA 结合，包括引物二聚体（Primer Dimers），这就会 使结果偏大。如何消除引物二聚体并提高灵敏度？ 理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与 “变性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR 过程中产生极少引物二聚体，极 少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。 （1）设计适合Real time PCR 的引物。 AppliedBiosystems 公司建议用Primer Press 软件来专门设计real time PCR 引物。 一些常见的基因引物序列可以借鉴其他成功的研究者。 （2）除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度。 （3）减少配试剂到开始反应之间的非特异扩增。（缩短时间+冰上操作 ） （4）PCR 使用热启动酶，UNG 酶。 Part three-Real-time PCR 原理及应用游离时无荧光 信号和DNA双 链结合时， 发出荧光每次实验都必须同 时扩增内参基因 Part four(Discussing)-从发现到分析,再到应用解决（临床问题）基因研究平台少量样本数更多样本数少量基因Genome-wide Survey 10,000基因Pathway focesed surey 30-1000基因Ion torrent 高通量测序 平台全基因组 mRNA/小 RNA检测发现新 RNA分子高密度全基 因组杂交芯片 microArray全基因组检 测已知 mRNA低密度 TaqMan Array单个信号通 路/基因家族/ 疾病关联基因 /microRNA 检测个别基因 real-time PCR检测TaqMan ArraysTaqMan芯片TaqMan Array Family96孔板 TaqMan Array Plate384孔TaqMan Array(低密度芯片/ 微流卡)所有TaqMan Array反应孔中都预先固化了 TaqMan 探针和引物3072孔超高通量荧光定量平台 OepnArrayTaqMan基因表达芯片从基因通路网络工 具(GeneAssist）搜 寻目的基因表达检 测试剂盒定制成96孔板或384孔微流卡 芯片运行定量PCR，分析数据。 同时分析几十到上百个基因表 达Ambion mirVana KitsDiscovery to Diagnostics Anti-miR miRNA Inhibitors & Pre-miR miRNA Precursors TaqMan miRNA Array & 7900HTTaqMan miRNA AssaysIon TorrentTMNext Gen SequencingRNA IsolationDiscovery Profile microRNAsValidateFunctional StudiesPublish / CommercializeComplete Solution for MicroRNA Profiling, Validation & CharacterizationRx/Dx TheranosticsDevelopment与大家共勉！