疫苗制造基本程序葛俊伟项目一细菌性灭活疫苗制造项目二细菌性活疫苗制造项目三病毒疫苗的制造内容内容项目一项目一细菌性灭活疫苗制造灭活细菌疫苗通用制造程序菌种的选择菌种的选择 菌液培养菌液培养 灭活灭活配苗配苗 浓缩浓缩 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多， 但制造的基本程序差别不大。 一、细菌性灭活疫苗制造基本流程菌液佐剂+乳 化分装和保存原料配置灭活菌液灭活一、细菌性灭活疫苗制造（一）菌种与种子 1.菌种制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品 系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干 保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特 性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。 2.种子培养将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进 行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗 生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。 菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机 械化或自动化的培养方式。机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供 选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养 法、透析培养法及连续培养法等。 菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的 细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所 以比较适用于制备诊断用的抗原。 一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（三）灭 活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取 最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示 。 表 几种灭活菌苗的灭活方法 一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（四）浓 缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高 菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法以上方法可使菌液浓缩一倍以上。此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹 毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐 酸食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。 一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗（五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同 。氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、 11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭 活菌液配制。配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。 一、细菌性灭活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养灭活灭活浓缩浓缩配苗配苗项目二项目二细菌性活疫苗制造弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所 传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。 菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性 和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。 将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养， 经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。 种子液通常在04C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量 种子使用。 细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程 序相同。（一）菌种与种子二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓缩浓缩配苗配苗按1%3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求 进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过 滤除菌的热空气进行培养制造菌液 如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗 下制成菌液 菌液于04C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格 后使用。（二）菌液培养二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓缩浓缩配苗配苗经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即 进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立 即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。 （四）配苗与冻干为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常 用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入 0.2% 0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩 菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。（三）浓缩二、细菌性活疫苗制造菌种的选择菌种的选择菌液培养菌液培养浓缩浓缩配苗配苗流程图1细菌疫苗制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌 种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒检验配制 灭菌检验配制 灭菌原 料佐 剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培 养菌苗原液配 苗活疫苗保护剂菌 液分装、冻干分 装灭活原 料活化 种子项目三项目三病毒疫苗制造病毒性禽胚培养疫苗制造病毒性细胞培养疫苗制造病毒性动物组织疫苗制造 一、病毒性禽胚培养疫苗制造 受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以 免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和 湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接 毒培养。 痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然 利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒 疫苗等。禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单 ，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。（一）鸡胚选择鸡胚鸡胚选择选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获配苗配苗（二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒 两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存， 保存的种毒多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定 符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒 价测定和其他项目的检定等。 一、病毒性禽胚培养疫苗制造 种毒与毒种继代种毒与毒种继代鸡胚鸡胚选择选择接毒与收获接毒与收获配苗配苗（三）接毒与收获 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫 苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。接种途径：绒毛尿囊膜接种 1112日龄胚尿囊腔接种 911日龄胚羊膜腔接种 1012日龄胚卵黄囊接种 58日龄胚如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种 0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊 膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.接毒一、病毒性禽胚培养疫苗制造 接毒与收获接毒与收获鸡胚鸡胚选择选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标 准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.539C、相对湿度 60%70%条件培养增殖，收集接毒后2448h内死亡胚， 置010C冷却424h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿 苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻 干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48120h内死亡的 鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用 。 2.培养收获按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进 行配苗。1.湿苗通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素5001000U，放置 010C 冷暗处处理后分装。2.冻干苗经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加 入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素 5001000U，混合后分装冻干。3.灭活苗收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液， 按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫 苗，放置4-10C保存。（四）配 苗一、病毒性禽胚培养疫苗制造 配苗配苗鸡胚鸡胚选择选择种毒与毒种继代种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获流程图2病毒性禽胚疫苗制造工艺流程受精卵禽 胚毒 株种 毒灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原 料佐 剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液配 苗活疫苗保护剂分装、冻干分 装灭活原 料种 子扩增 收获配制纯化病毒悬液接种二、病毒性细胞培养疫苗制造用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无 菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门 检定分发。领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种， 制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种， 或为冻干毒种。 细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以 强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序 既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细 胞及细胞培养方法也有所不同（一）种毒与毒种继代接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据 病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方 便、制备简单、生命力强。如猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫苗采用犊牛睾丸原代细胞 ；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫 苗采取BHK21细胞增殖病毒等。（三）细胞制备 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的 生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有 5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和 悬浮培养在我国尚处于试验之中。 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时 或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小 病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎 细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%- 2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现 70%-85%以上细胞病变时即可收获。病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养 瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取 ；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无 菌检验、毒价测定合格后供配苗用。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造（五）配 苗 1灭活疫苗不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按 规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭 活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入 佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2冻干苗细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分 装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。 接毒与收获接毒与收获种毒与毒种继代种毒与毒种继代配苗配苗细胞制备细胞制备二、病毒性细胞培养疫苗制造流程图3病毒性细胞疫苗制造工艺流程动物或胚胎组 织毒 株种 毒灭活病毒消化鉴定培育培养检验检验配制原