第七章 细胞培养的污染及控制n污染是细胞培养的大敌。预防和避免 污染是细胞培养成功的关键之一。一 开始就要十分重视，应积极采取措施 ，防止污染，否则会前功尽弃，不仅 浪费时间，而且浪费人力、物力，甚 至造成无法弥补的损失。第一节 污染的类型及鉴别n细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。一、细菌污染n细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌，以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。n细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响.一、细菌污染n培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。n被洋葱佰克霍尔德菌污染（假单胞菌属，是 植物病原菌，因引起洋葱患病而得名）二、真菌污染n是细胞培养过程中最常见的一种，尤在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌。n培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或 培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆 形散在细胞周边和细胞之间。n镜下看时，要将培养瓶用酒精棉擦干净，以防止与瓶 外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细 胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞 脱落死亡。污染的鉴别n细菌、真菌污染的检测： 肉眼直接观察法、 培养检查法和显微镜观察法n1肉眼观察n细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开 放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污 染，在48hr内可明显观察到。如培养液变混 浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。n2显微镜下观察n细菌污染大多数可以使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。n在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。n3培养检察n采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可 发现是否有污染。n怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养，24小时内可以获得结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。n白色念珠菌污染 三、支原体污染及检察造成支原体高污染率的原因： 1.支原体大小0.10.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）； 2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式； 4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染； 5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。三、支原体污染n培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体污染的检测n1相差显微镜观察n将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用 长形盖玻片)，24小时后用清洁镊子从培养瓶中取出 支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖 玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接 取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。 支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之 间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞 破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。2低涨处理地衣红染色观察n取样：（1）取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液， 用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。n固定：（2）用新配制的Carnoy液固定两次，每次10分 钟，取出盖片凉干。n（3）用培养液时，先吸取1mL，500800r/min离心5分 钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中 ，置10分钟，加入Carnoy液固定。2低涨处理地衣红染色观察n（4）离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成23 张涂片。n染色：（5）然后用2%醋酸地衣红(地衣红2g，冰醋酸60mL，加蒸馏水至100mL)染5分钟。n脱色：（6）纯酒精过三次，每次1分钟，封入Euparal或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色 ，再封片。n观察：（7）镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于 细胞外或细胞之间。3荧光染色法观察 n原理：利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体污染。 3荧光染色法观察 n（1）用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在 细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中。n（2）用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸甲醇固定 10minn（3）用生理盐水漂洗后置于50g/mL的Hoechst 33258 (生理盐水配制)中染色10min。n（4）置于蒸馏水漂洗12min，向细胞面滴加数滴 pH5.5磷酸缓冲液。n（5）置荧光显微镜下观察。n若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加35滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。n只观察到细胞的细胞核， 没有被支原体污染的细胞 n n细胞核外及细胞表面出细胞核外及细胞表面出 现蓝色荧光小点和丝状现蓝色荧光小点和丝状 点，被支原体污染的细点，被支原体污染的细 胞胞4电镜检测n若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养4872小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。支原体5培养检测n（1）将2.5109/L细胞悬液5mL加入45mL支原 体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产 的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀。n（2）然后取0.5ml加入已冷却到50的培养基 中，再用琼脂培养基做分离培养。n（3）37培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出 现。n琼脂糖板上的支原体克隆四、病毒污染n采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。五、非同种细胞污染n细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养中操 作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染 能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、 不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原 来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。常用观察细胞形态 学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉 污染的细胞。nERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是HeLa细胞 。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许 多实验宣告无效。n非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由 于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质 所致。第二节 污染来源n细胞培养中污染来源主要有以下五条途径 ：不洁的动物组织标本、空气、清洗消毒、操作、血清n1、不洁的动物组织标本n很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通 的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但由于 取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含 有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸 泡，也会带菌，造成细胞污染。2、空 气n空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。3、清洗消毒n培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。4、操 作n来自操作者的污染主要有以下几方面：n器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否 已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末 重新处理。n操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体 。n培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。n操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到 了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。n操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等。n5、血清n市售血清灭菌不彻底，潜在病毒和 支原体污染。第三节 污染的清除和预防n一、污染的清除n培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之。有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。1使用抗生素n抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100g/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。n此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘 菌素、四环素、制霉菌素等。常用400800g/mL卡那霉素或200g/mL四环素处理，每隔23日换液1次，传12代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉 (Ciprofloxacin，Cip)、截耳素衍生物和四环素衍生物等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。2加温处理n将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41加温处理效果更佳。3使用支原体特异性血清n用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。4其他方法n除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法 、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等。n动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能 在体内继续生长，一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖 。n巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成 分，