1邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制作者：敖红，林玲，阚海东，陈秉衡，张蕴晖【摘要 】 目的 研究邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法 运用 RT-PCR 方法观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对大鼠子代不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质(MIS)、雄激素结合蛋白(ABP)和抑制素(inhibin)表达水平的影响，并采用 ELISA 法检测DBP 染毒后大鼠睾酮水平的变化情况。结果 与对照组比较，各DBP 染毒组大鼠睾丸中 MIS 表达差异无统计学意义，血清总睾酮水平差异无统计学意义，但高剂量 DBP(1000mg/kg)组睾丸支持细胞中 ABP 和抑制素(inhibin)的 mRNA 表达量显著减少，且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论 环境内分泌干扰物 DBP 可干扰大鼠发育过程中睾丸支持细胞 ABP 和 inhibin 的表达，其对性腺发育的影响可能是 DBP 雄性生殖毒性的主要作用机制之一。 【关键词】 邻苯二甲酸酯类近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被认为是一种环境内分泌干扰物，主要表现为雄性生殖发育毒性(染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂等)1，2 。本研究以 DBP 为邻苯二甲酸酯类(phthalates)的代表物，观察 DBP 对发育过程中 F1 代幼2鼠睾酮(T)水平和雄激素结合蛋白(Androgen-binding protein,ABP)、抑制素(inhibin)、苗勒氏管抑制物质(MIS)基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑-垂体- 性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。1 材料与方法11 试剂 DBP(分析纯，纯度995% ，上海溶剂厂)；吐温-80(化学纯，符合 Q/CYDZ-162-97，中国医药集团上海化学试剂公司)；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒(美国 Biotech公司)；单克隆兔抗带状闭合蛋白1(zona cocludens1)，ZO1)抗体(美国 Zymed Laboratories 公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC山羊抗兔 IgG)(北京中山生物医学有限公司 )。12 剂量设置及试剂配制 共设 3 个染毒组，DBP 染毒剂量依次为 50，200 ，1000mg/kg。另设 1 个溶剂对照组(0mg/kg)。准确称取 100g DBP 置入干净的烧杯中，按 12 比例加入吐温80和精制植物油，定容至 500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组，溶剂对照组用 12 的吐温80 和植物油加蒸馏水配制而成，其中吐温80 和植物油的用量同高剂量组。13 动物来源及染毒方法3131 实验动物 SPF 级 Sprague-Dawley 大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，沪动合格证字 152 号，NO.02-4-20，雌性 100 只，体重(20020)g ，雄性 50 只，体重(30030)g。132 饲养条件 清洁级动物房，温度为 (223) ，相对湿度为 50%60%，人工照明，12h 光照， 12h 黑暗。动物食用标准颗粒饲料，自由饮水。133 染毒方式 孕鼠灌胃染毒，自妊娠第 1d(gestation day 1,GD1)至哺乳期结束出生后 21d(postnatal day 21,PND21)，每天 1 次，灌胃容积为 05ml/(100gbw)。停止染毒后，F1 代雄鼠饲养至性成熟期 PND70d。134 实验设计 清洁级 SD 成年大鼠，适应性饲养 1 周后，按 12 比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天清晨固定时间做阴道涂片，显微镜下查涂片上有无精子以确定是否受孕。查到精子后，将受孕大鼠取出，按体重随机分配至 4 个实验组，查到精子的当天确定为妊娠第 0d(GD0)。2 周交配试验结束后，弃去雄鼠和未怀孕的雌性大鼠，每个实验组由 20 只怀孕母鼠组成，自受孕第 2d(GD1)开始，灌胃染毒至哺乳期结束(PND21)；每天称重一次，并根据体重4调节染毒容积；出生后 4d(PND4)按照欧洲经济合作与发展组织(OECD)实验指南(No.414)要求3 ，为保持仔鼠营养的均衡性，进行窝标准化操作，即保持每窝 8 只仔鼠(4 只雌鼠，4 只雄鼠)，不足 8 只的窝剔除，这样对照组、低剂量组和中剂量组各有 16 窝，高剂量组有 14 窝。F1 代雄性仔鼠出生第 1，4 和 21d，每组选取5 只动物，无菌环境中，迅速取下睾丸组织，立即置于放在干冰上的无酶离心管中，-70保存至 RNA 抽提。14 血清睾酮水平的测定 采用 ELISA 方法测定 PND70d 大鼠的血清睾酮水平，睾酮酶联免疫试剂盒(美国 Biotech 公司) ，按试剂盒说明进行操作。15 RNA 的提取 用 TRIzol 试剂一步法提取睾丸组织总RNA。16 RTPCR 引物 根据 Genebank 中 SD 大鼠的 RNA 序列，用 Primer5 引物设计软件自行设计 ABP、Inhibin 和 MIS的引物序列。actin(470bp):Sequence 5CGGATGTCCACGTCA CACTT3,antisequence 5GTTGCTATCCAGGCTGTGCT3;ABP(286bp):Sequence 5ATCAACTGCTTGGGGTTCAC3,antisequence 5GAGCCTGGTCAGAGGCATAG3;Inhibin(208bp):Sequen5ce 5GCTCTACCAGGGAGCATGAG3,antisequence 5CACCTTCCTCCTAGCTGACG3;MIS(307bp):Sequence 5AGCAAGGCTTCCCTGACGGT3,antisquence 5CAGGGTATAGCACTAACAGG3;GAPDH(153bp):Sequence 5GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3,antisequence 5TGTCATATTTCTCGTGGTTC-3。17 RTPCR 程序 向 RTPCR 反应液中加入 1l 的引物及3l 的模板，混匀后放入 PCR 仪中反应。PCR 扩增条件：50 逆转录 30min；94预变性 2min；94 30s，5564 30sactin 和 ABP 的退火温度为 56 ，inhibin、MIS 和内标磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde3Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)的退火温度为 58 ，72 60s,3035次循环；72延伸 10min。取 5l 水浴产物与 1l 加样缓冲液混匀，加至凝胶的加样孔中，电泳。电泳 1530min 后在紫外灯下观察结电泳结果，在凝胶成像系统下成像扫描目标 DNA 片段的灰度，进行半定量分析。18 统计方法 采用 SPSS110 软件，进行方差分析。62 结果21 PND1d F1 代大鼠睾丸 MIS 表达( 图 1、表 1) 结果可见，片断长度为 304bps 的性别分化相关基因 MIS 在对照组和各 DBP染毒组大鼠睾丸中表达差异无统计学意义。22 PND70d F1 代大鼠血清睾酮水平 DBP 宫内暴露和哺乳期染毒，F1 代仔鼠生长至性成熟期后，取血清测定睾酮含量，以观察 DBP 对仔鼠睾酮水平的影响。结果表明随着染毒剂量的增大，F1代大鼠血清睾酮水平逐渐降低，但经统计学分析，各组间睾酮水平的差异无统计学意义(P005) 。23 PND14 和 PND21d F1 代大鼠睾丸 ABP 和 inhibin 表达(图 2、图 3 表 1) 结果表明，与对照组相比较，高剂量组1000mg/(kgbw)PND14 和 PND21 大鼠睾丸 ABP 和 inhibin表达量显著降低，而低剂量组和中剂量组50 和 200mg/(kgbw)比较则差异无统计学意义。ABP 在 PND21 的表达量略高于PND14，而 inhibin 在 PND14 表达量高于 PND21。表 1 DBP 染毒幼鼠 ABP、inhibin 和 MIS 基因表达结果（略）注：与对照组比较，a PC：溶剂对照组；L：50mg/kg 7DBP 染毒组；M：200mg/kg DBP 染毒组；H：1000mg/kg DBP染毒组图 1 DBP 染毒 PND1d F1 代仔鼠睾丸中 MIS 表达情况（略）C：溶剂对照组；L ：50mg/(kgbw) DBP 染毒组；M：200mg/(kgbw) DBP 染毒组；H：1000mg/(kgbw) DBP 染毒组图 2 DBP 染毒 PND14d 仔鼠睾丸中 ABP 和 inhibin 表达情况（略）C：溶剂对照组；L ：50mg/(kgbw) DBP 染毒组；M：200mg/(kgbw) DBP 染毒组；H：1000mg/(kgbw) DBP 染毒组图 3 DBP 染毒 PND21d 仔鼠睾丸中 ABP 和 inhibin 表达情况（略）3 讨论8目前研究普遍认为，抗雄激素样活性是 DBP 的雄性生殖发育毒性的毒作用基础4-7 。体外实验研究结果已证实，DBP 及其代谢产物单丁基邻苯二甲酸酯(MBP)均不能与雄激素受体(AR) 结合，说明其抗雄激素作用不是通过 AR 进行的。研究发现，DBP 染毒可致胎鼠睾丸内睾酮水平下降，而睾酮对于雄性生殖系统的发育和分化具有十分重要的作用(可促进睾丸从腹股沟下降至阴囊和附睾、精囊腺及外生殖器的正常发育等)。因此，DBP 染毒大鼠后代出现的附睾发育不良、尿道下裂及隐睾等损害均可能与 T 下降有关8-12 。本研究发现，随着 DBP 染毒剂量的增加，血清 T 水平逐渐下降，但与对照组相比较差异无统计学意义，考虑是由于酶免方法测定的是总 T 水平，而 T 需要与支持细胞分泌的 ABP 结合，才能在曲细精管上皮维持较高浓度及运输至附睾，促进精子生成、成熟及附睾发育成熟，而 inhibin 也是由支持细胞分泌的糖蛋白，含一个通用的 亚单位和一个性质不同的 亚单位，其作用是通过下丘脑 -垂体-性腺轴负反馈调节激素分泌，主要对 FSH 分泌起抑制作用，也可在曲细精管内减少精原细胞的有丝分裂。结果表明，高剂量1000mg(kgbw)的 DBP 能够减少睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白和 inhibin 的 mRNA 表达量，说明 DBP 可以通过损伤睾丸支持细胞，使其分泌的蛋白 ABP 和 inhibin 明显减少；另一方面，ABP 的生物学功能是与睾酮结合，发挥睾酮的生物学作用，其表达减少导致能发挥有效生物学作用的睾酮水平下降，这可能是 DBP 致附睾发育不全等雄激素依赖的生殖系统损害的一个可能的作用机制。9另外，DBP 的生殖发育毒性还可能与胚胎性别分化过程中的 MIS 密切相关2 。因此，本研究用 RT-PCR 方法观察 DBP 对 MIS 表达的影响，结果表明，DBP 宫内暴露和哺乳期染毒的 F1 代雄性仔鼠睾丸内 MIS 表达无明显改变，说明 DBP 对 MIS 明显影响，DBP 的生殖发育毒性作用并不是通过该途径。本研究结果表明，DBP 宫内暴露和哺乳期染毒的 F1 代雄性仔鼠睾丸内 MIS 表达无明显改变，大鼠血清中总睾酮水平也没有明显改变，但高剂量1000mg(kgbw)的 DBP 能够显著抑制大鼠睾丸支持细胞 ABP和 inhibin 的表达，ABP 表达量降低导致有生物学功效的睾酮水平下降，因此，DBP 的雄性生殖发育毒性可能并不是通过 MIS 抑制胚胎分化过程，而主要是改变了与睾酮结合的相关蛋白表达和干扰下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈过程，从而引起