Gene diagnosisGene diagnosis By黄黄 春春 洪洪G到T一个碱基的改变，决定了一 个人的命运 小皓珩出生23个月就出现皮疹、便血等病状，患上了罕见的原发性免疫缺陷病。 DNA序列分析，证实了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突变为T，使编码谷氨酸的密码GAG突变为终止密码TAGWAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白，导致患儿血小板减少，淋巴细胞形态和功能异常 希望：WAS目前已经可以用骨髓移植或干细胞移植根治 Wiskott-Aldrich综合征（WAS）是一种罕 见的血液病，以儿童为多见，重者多死于 儿童期，呈X连锁隐性遗传。临床上表现 为血小板减少、湿疹和免疫缺陷三联征 WASP基因包括12个外显子，基因组DNA 长约9kb,其cDNA由1821个碱基组成，编码 502个氨基酸残基的开放阅读框 第一节 概述一、 基因诊断概念利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从DNA DNA 水平检测人类遗传水平检测人类遗传 性疾病的基因缺陷，性疾病的基因缺陷，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。传统的诊断、问、望、听、触 经验型判断的方法。、化验/检验细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。 、影像学X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。 、特殊检查染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。 但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断在第18届国际遗传学大会上，全世界3000名科学家对人类 的生老病死做了新诠释“不论是器质性疾病还是功能性疾 病，都有必要在基因水平上去探究病因”。除此之外，人类正 常的发育、衰老和死亡，当然也受基因的调控。”基因诊断的特征：1 不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2 症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3 产前诊断避免患儿出生，提高人口质量我们先看一个短片单基因遗传病：v分类 ：常染色体隐 性遗传病：常染色体显 性遗传病：常染色体 遗传病伴性遗 传病多指、并指、软骨 发育不全先天性聋哑、白化 病、苯丙酮尿症伴X显性遗传病 ：伴X隐性遗传病 ：抗维生素D佝偻病红绿色盲、血友病、 进行性肌营养不良基因疾病21三体综合征（先天性愚型）重型地贫: 胎儿水肿综 合征 早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法Pop-Question 一个患抗维生素D佝偻病的男子与正常女子 结婚，怀孕后，进行了遗传咨询，你认为 正确的建议是（ ） A.只生女孩 B.怀孕期多补钙 C.不要生育 D.只生男孩v我国人口中有20%-25%的人患有各种遗传病！其中 单基因遗传病约3%-5%，多基因遗传病约15%-20%， 染色体异常遗传病约0.5%-1%。v每年新出生的儿童中，有先天性缺陷的约1.3%，其 中70%80%是遗传因素所致。在自然流产儿中，约 50%是染色体异常引起的！v我国人口中患21三体综合症的人就在100万以上。遗传病的 危害母亲生育年龄21三体综合征发病率45岁1/50母亲生育年龄与21三体综合征发病率之间的关系中山大学达安基因诊断中心 根据出生缺陷监测和残疾儿调查结果显示 ，我国是出生缺陷高发国家，每年有近100万出生缺陷儿发生，30在出生前后死亡，40造成终生残疾，只有 30可以治愈或纠正。在这些出生缺陷儿中，80%是由于遗传因素造成的。 据监测数据显示：1997年2008年北京市 出生缺陷总发生率呈上升趋势，尤以2003 年以后上升明显。1997年北京市出生缺陷 总发生率为90.78/万，2001年为104.21/万 ，2007年为180.68/万，2008年为170.82/ 万。十年间，出生缺陷发生总率上升了一 倍。 基因诊断方法和传统的疾病诊断方法表型诊断（传统方法） 基因诊断 （一）诊断依据 疾病表型变化 基因结构异常和表达异常 （二）分 类 临床诊断（病因、病解、病生） DNA诊断 血清学诊断 RNA诊断 生化学诊断（三）特异性 表型改变在很多情况下是非特 以探测基因为目标，只要异性的，往往难以明确诊断， 有特异性探针，利用分子延误病情? 杂交原理即可 诊断，具有很高的特异性。（四）敏感性 探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNA pg水平即可。（五）早期诊断 因为表型改变往往出现较晚， 在表型改变之前，基因难以早期诊断 结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。（六）基因诊断范围广因为：探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未 知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性 基因，所以适应性强，诊断范围广。被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化 阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤 疗效及预后尤为重要。在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体 ，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性 E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩 大了实验室诊断范围。（七）二者关系1. 基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）2. 基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。3. 尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）4. 同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云。基因诊断的应用范围1.检测病原微生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.诊断先天遗传性疾患，产前诊断优生学3.检测后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。4.其他如亲子鉴定、个体识别、法医物证。爸爸妈谁妈谁 要我要我 ？遗传病基因诊断的现状 人类已知的单基因遗传(包括基因和异常表型位点)总数超过1万4千种,都列入OMIM(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM)我国各种先天性缺陷和遗传性疾病约占5% 美国目前就有100多个遗传病分子诊断实验室开展300多种基因病的分子诊断。所有实验室均需标准化 (实验室认证,人员资格认证)国外遗传病检测的项目常染色体显性遗传病 诊断性遗传检测基因 软骨发育不全症 FGFR3 Marfan综合征 FBN1 Charcot-Marie-Tooth神经病 PMP22,EGR2,MPZ,NEFL,MTMR2 先天性心脏病(LQTS),各型 KCNQ1,KCNH2,SCN5A,KCNE1 神经纤维瘤(1型, 2型) NF1,NF2 多囊肾(1型, 2型) PKD1,PKD2 结节性硬化(1型, 2型) TSC1,TSC2 遗传性高胆固醇血症 LDLR 染色体隐性遗传病 诊断性遗传检测基因 囊性纤维化症 CFTR 先天性神经性耳聋(SNHL), GJB2,GJB3,SLC26A4 先天性心脏病(LQTS) KCNQ1, KCNE1 地中海贫血症, B型HBB(血红蛋白B链) 白化症 OCA1 苯丙酮尿症 PAH 脊柱肌萎缩症 SMN1 肝豆状核变性(Wilson)病 ATP7B 多囊肾 PKHD1,PKHDL1 先天性代谢病 X-连锁隐性遗传病 诊断性遗传检测基因 杜兴肌营养不良症 DMD Rett综合征 MECP2 血友病(A型, B型) F8,F9 白化症 OA1 G-6-PD缺乏症 G6PD X-连锁显性遗传病 遗传性肾病(Alport syndrome) COL4A5Y-连锁遗传病 性反转病 SRY SOX9 无精症或少精症 DAZ 基因诊断 方式间接诊断 （诊断与致病基因连锁的基因 ）直接诊断 （直接诊断致病基因）一、疾病相关遗传标志的连锁分析 （间接诊断）适用于连锁分析的遗传标志应具备三个特点：1.不同个体间存在多态性；2.有足够的家系成员样本以确定 标志基因与致病基因间的连锁关系；3. 紧密连锁，排除减 数分裂中出现重组的可能。此外，标记基因的数量要足够多 ，最好能高密度遍布整个基因组。遗传标志：第一代 RFLP标志（限制性片段长度多态性）第二代 微卫星标志（短串联重复序列）第三代 SNP标志 （单碱基多态性）疾病基因定位和克隆 利用连锁分析或关联分析找出疾病基因在染色体 基因组上的位置。用现有的能覆盖全基因组的多态性标记（STR, SNP) ，进行全基因组扫描，发现与疾病基因连锁或关联的遗传标记，就可以大致确定疾病 基因的定位。疾病基因遗传标记1遗传标记2遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记位置已知，就可确定疾病基因的位置。 遗传标记1、2与疾病基因连锁或关联。其它不连锁。1. RFLP(限制性酶切长度多态） Restriction fragment length polymorphism基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对 位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断 待测DNA的突变情况。-GAATTC-GAATTT-GAATTC -CTTAAG-CTTAAA-CTTAAG-GAATTC-GAATTC-GAATTC -CTTAAG-CTTAAG-CTTAAGAATTC-GAATTT-GG-CTTAAA-CTTAAAATTC-GG-CTTAAEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIRFLP分析法镰状细胞贫血的基因诊断 限制性内切酶Mst切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一种核苷酸）， 切割正常DNA产生1.1kb 珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时， 由于AT破坏了Mst的位点，便形成1.3kb 珠蛋白的DNA片段。Mst酶切位点(GCTNAGG)53正常基因53突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+ +0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变