实验五目的基因的原核表达及检测现代分子生物学大实验实验目的 重点掌握表达载体构建的原理及方法 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方 法 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 掌握考马斯亮蓝染色的方法实验原理 目的蛋白质的诱导表达 目的蛋白质的纯化 目的蛋白质的检测实验原理 蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后 导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。 体内很难分析单个蛋白质的作用 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面实验原理图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白 在Hela细胞中的荧光显微镜检测（400）例 酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统 表达的蛋白具有正常的 活性、构象 技术难度较大、耗时、 耗资 大肠杆菌表达系统 实验技术简单，时间 较短，费用低，系统 比较完备 不能有效地对重组蛋 白质进行修饰加工， 易形成包涵体原核细胞表达系统 真核细胞表达系统实验原理 原核细胞表达系统菌株 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表 达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌 株往往成为理想的起始表达菌株。 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺 陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。 大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚 合酶基因，为T7表达系统而设计。 实验原理 原核表达质粒的构建 目的基因 表达载体PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位点实验原理 目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer 例： p38中抑制多肽16肽序列 GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC F 5-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT- 3 R 5-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-35端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位 点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7 个氨基酸的碱基序列。 3端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位 点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽 碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。实验原理 表达载体 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基 础上增加表达元件，就构成了表达载体。 元件 启动子、终止子、核糖体识别序列 诱导性表达所需要的元件 操纵子序列 调控基因 多克隆位点 融合Tag 复制起始序列 筛选标记/报告基因 各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。实验原理启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac， PL和PR，T7是最常用的启动子， 转录终止子 核糖体结合位点启动子、终止子、核糖体识别序列操纵子序列及配套的调控基因 诱导性表达所需要的元件 多克隆位点 复制起始序列实验原理用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag） 。 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目 的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。目前常用的标签有 组氨酸标签（His-Tag） 谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase）标签（GST -Tag） 硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）标签 麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP） 蛋白质 A（protein A） 纤维素结合位点（cellulose binding domain）标签等。一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达 ；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的 影响。实验原理 筛选标记/报告基因表达 抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana， 新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干 扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是 否和代谢物相互作用。 GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了， 半乳糖苷酶，荧光素酶。 一些融合表达Tag也有报告基因的功能。实验原理 常用表达载体 pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST） 融合蛋白表达系统的载体。 Ptac Promoter Amp pGEX - KG pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 T7 Kana pET - 14b实验原理 目的蛋白质的诱导表达 lacI q（Lactose） lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它 所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因 子，抑制转录启动。 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（- 半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以 正常表达，启动转录。 IPTG（异丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与 lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常 作为lac 操纵子的诱导剂而使用。实验原理AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtac PromoterAmprIPTG多克隆位点实验原理BamH INde IBamH IcDNA酶切Nde I基因片段酶切后的目的基因酶切连接转化筛选（蓝白斑）鉴定（PCR、酶切、测序 ）原核表达质粒的构建成功 原核表达的诱导条件 IPTG浓度： 0.01-5mmol/L 诱导时间：3h 诱导温度：15-42 实验原理 目的蛋白质的纯化 破碎细胞 超声破碎 溶菌酶裂解 从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白 GST可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由 于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱 甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合 蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液 ,洗脱结合的GST融合蛋白。 Poly His多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和 物结合，因此带HIS-6的蛋白能结合与固化的Ni2+树脂 ，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后， 再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白 。实验原理 目的蛋白质的检测 蛋白质分子量的检测 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 目的蛋白质的分析实验原理 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。 SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分 子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二 级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂 后，强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱 氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解 离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷 的蛋白质-SDS复合物。实验原理蛋白质中加入 SDS 并加热， SDS 分子上的非极性区 (黄色尾巴)会与蛋白质上的非 极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满 SDS 分子。SDS 分 子的极性区 (洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分 子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种 蛋白质分子间的天然的电荷差异。SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子 。97.0 kDa实验准备 诱导、培养 37恒温摇床 电泳检测 Hoefer miniVE Vertical Electrophoresis System 仪器与设备 LB培养基、Amp、IPTG 30%丙烯酰胺贮液 1.0M Tris(PH6.8)(浓缩胶),1.5M Tris(PH8.8)(分离 胶) 10%SDS，10%过硫酸铵（APS作用主要是提供自由基， 然后在促凝剂TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚 合。 ），四甲基乙二铵（TEMED可以催化过硫酸铵产生 自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 ） 1XTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris, 250mM 甘氨酸，0.1% SDS 1xSDS上样缓冲液：50mM Tris-HCl（6.8）， 100mM DTT，2% SDS，10% 甘油，0.1% 溴酚蓝 染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水0.5g R-250 脱色液：90甲醇：90冰乙酸：20水实验试剂实验步骤 培养 诱导 样品制备 SDS-PAGE 凝胶检测实验步骤1）挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液 ， 37培养过夜。2）取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培 养液，37振荡培养2h以上，至对数中期（A600=0.50.6） 。3）吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速 离心1min，沉淀悬浮于100ul PBS中，加入溶菌酶（终浓度 1mg/ml）37度消化。4）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37 继续培养 3h，取1ml样品放于微量离心管中，室温高速离心1min ，沉淀 悬浮于100ul PBS中，加入溶菌酶（终浓度1mg/ml） 37度消 化。 。5）消化后混合等体积的1 x SDS凝胶加样缓冲液，100度加热 3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后 上样。目的蛋白质的诱导表达及检测6 ）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边,安装好 7 ）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶 槽高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需 30min倒 掉水，用吸水纸吸干 8）配5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子 不溢出为宜），插入梳子 9）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中 10）制备好的样品加入上样孔11）连接电泳仪 12）打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶（大约需30min）后将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝 胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需2h，电泳结束。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶配制（mini VE ）12分离胶5%浓缩胶H2O2.45 ml 2.05ml 30%丙稀酰胺3.0 ml0.5ml Tris 缓冲液1.9 ml（1.5M pH8.8）375ul （1.0M pH6.8） 10%SDS75 ul30ul 10%过硫酸 铵75 ul30ul TEMED3 ul3ul 注：1 . 丙稀酰胺为神经毒剂，使用时要小心，操作请务必戴手套。2. 过硫酸铵需新鲜配制，并注意浓度，否则影响胶凝固。3. 1块胶可以用10 ml离心管，2块胶要使用小三角瓶便于混匀，配制后余液可暂时留存，便于参考胶凝固时间，一般30min即可。目的蛋白质的检测-考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue）是一种三苯甲烷纺织染料，又称 酸蓝83，分子上含有两个S03H基团，偏 酸性，能结合在蛋白质的碱性基团上。 能够检测出大于0.1ug蛋白条带。 将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色 4小时（或过夜）。 脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次， 浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37加热使 其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳 带为止。