植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体融合原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。v亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的 断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细 胞核，也可不具有细胞核。v核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生 质体。也称为微小原生质体。v胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。Protoplast system Organogenesis Regenerative abilityOntogenic processes Cell differentiation Somatic genetics Cell physiology Cell cloning Organelle, DNA uptake Cell fusion 应 用v 植物细胞育种中的核质替换v 细胞质杂种的获得v 远缘杂交创造新物种细胞v 细胞器的互作研究意 义植物原生质体的分离和培养 材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化 原生质体活力测定 影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养方法 影响原生质体培养的因素 原生质体再生过程Flash用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法 ，可提高某些材料原生质体的产量和活力。 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的 原生质体才能分裂。 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分 离原生质体，才能获得高产量。原生质体分离的方法机 械 分 离 法酶 解 分 离 法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预 处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。v缺点：获得完整的原生质体的数量比较少 ，能够用此法产生原生质体的植物种类受 到限制。v优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁 的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的 作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活 力的原生质体的方法。v常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半 纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类 （果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶 和胼胝质酶。酶来源生产厂家纤维素酶类Onozuka R-10绿色木霉Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USADriselaseIrpex lutensKayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan酶来源生产厂家果胶酶类Macerozyme R-10根霉Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanPectinase黑曲霉Sigma Chemical Co.Pectolyase Y-23黑曲霉Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS酶解法的优缺点v优点：获得量大，适用广泛。v缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、 过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。沉 降 法漂 浮 法不 连 续 梯 度 法原生质体纯化的方法飘浮法Protoplastv采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。v优点：可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。v缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。沉 降 法v利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。v优缺点： 纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。v又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。v优点：可以收集到数 量较大的纯净原生质 体，同时避免收集过 程中原生质体因相互 挤压而破碎。12mL 碎片带含原生 质体带0.6mL 0.45M蔗糖0.45M 甘露醇不连续梯度法原 生 质 体 鉴 定v低渗爆破法v荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)原 生 质 体 活 力 测 定v形态识别形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中 ，可正常膨大。原 生 质 体 活 力 测 定v荧光显微镜识别(FDA法)FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。使用浓度：0.01%原 生 质 体 活 力 测 定v酚藏花红染色法（0.1%)酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evans blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法影响原生质体数量和活力的因素v供试材料及预处理方法v酶解条件： 酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度v渗透压稳定剂v质膜稳定剂v分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续 时间。v分离用具 酶的种类、组合、浓度材料纤 维 素酶半 纤 维 素酶崩 溃 酶果 胶 酶离析 酶蜗 牛 酶研究者烟草叶片禾谷类叶片油菜花粉马铃薯子叶马铃薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.10.20.50.51.0UchimiyaScott李仕琼戴朝曦王蒂几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)材料纤维 素酶半 纤 维 素酶崩溃 酶果胶酶离 析 酶研究者枸杞愈伤组 织檀香幼叶檀香愈伤组 织榆幼叶山毛榉幼叶胡杨悬浮细 胞0.52.01.00.10.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.010.030.11.00.20.50.5孙勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja诸葛强几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)pHv分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的 问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH 值是不一致的。v如制备菜豆叶片原生质体时： 低pH（40%）交变电场的振幅频率100 V/cm交变电场处理时间20s支流高频电压1100V/cm脉冲宽度60us脉冲次数1融 合 类 型v自发融合v诱发融合v对称融合v非对称融合 核失活细胞质失活Flash影响原生质体融合的因素v原生质体质量至关重要，高质量的原生质体 是细胞融合的首要条件。v融合方法v融合参数，包括各种融合液都应选择适当。融 合 体 类 型v异核体(heterokaryon)或异核细胞基因型不同的原生质体融合成杂交细胞 v同核体(homokaryon)基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞 v非对称杂种或细胞质杂种细胞质工程 (cytoplasmic engineering)v细胞质工程 又称细胞拆合工程是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核 分开，再进行不同细胞间核质的重新组合 ，重建成新细胞。v可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研 究和育种工作。 细胞质工程v细胞质杂种应用细胞融合技术，使两种来源不同的核 外遗传物质与一个特定的核基因组结合在 一起细胞质杂种获得途径（4条）：v一个正常原生质体与一个去核原生质体融合；Lorz等（1981）用密度梯度离心（5 50% Percoll，2000040000g， 4090min）获得高纯度的去核原生质体。细胞质工程v细胞质杂种获得途径一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合v使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明异核体形成后，两个核中有一个消失；较晚时期，染色体选择性消失。体细胞杂种产生的其它途径v细胞器移植叶绿体移植v叶绿体的来源 叶片机械法低速离心 原生质体低渗涨破低速离心v叶绿体的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心v叶绿体的转移夹层离心法和PEG诱导融合应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过 摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。v细胞器移植细胞核移植v细胞核的来源 植物组织机械法（加Triton X-100）过滤离心 原生质体低渗涨破(加Triton X-100)过滤离心v细胞核的纯化Percoll或蔗糖密度梯度离心v细胞核的转移夹层离心法：原生质体核原生质体核PEG诱导电场诱导和微注射体细胞杂种产生的其它途径体细胞杂种产生的其它途径v微生物移植内吞作用摄入固氮根瘤菌v外源染色体和DNA的摄入染色体分离v细胞同步化处理原生质体涨破差速离 心（200 g,10 min；1000g，20 min）转移方法vPEG诱导，显微注射v农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据可见标记性状 的机械选择法体细胞杂种选择及杂种植株鉴定。 FITC(异硫氰酸 荧光素)在荧光显 徽镜下呈绿色 RITC (异硫氰酸 罗丹明) RITC在荧 光显徽镜下呈红色体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v根据其遗传和生理生化特性的互补选择 法互补选择法v互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗 传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生 互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。抗性互补选择法营养代谢互补选择法生长互补选择法 矮牵牛+爬山虎融合体的选择原生质体矮牵牛爬山虎冠瘿 混合体融合处理矮牵牛+爬山虎细胞团愈伤组织（异核体）NT培养基MS培养基( 无激素)NT培养基NT培养基细 胞 团MS 培养基 (无激素)死亡MS 培养基 (有激素)愈伤组织原生质体细胞团MS 培养基 (无激素 )死亡 愈伤组织体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v细胞学鉴定利用染色体显带技术，以亲本染色体为对 照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带 型进行观察。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定v同功酶鉴定根据亲本和杂种同 功酶谱的差异来鉴 别杂种。有的呈双 亲谱带的总和、有 的出现新谱带或丢 失部分亲本谱带。 常用的鉴定酶为： 乙醇脱氢酶、乳酸 脱氢酶、过氧化物 酶、酯酶等。体细胞杂种选择及杂种植株鉴定vDNA分子标记鉴定是在DNA水平上对 亲本和杂种植株遗 传差异进行鉴定的 一种技术。依据DNA的多态性（ polymorphism）Random Amplified Polymorphic DNA体细胞杂种选择及杂种植株鉴定小结v原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是 进行各种细胞操作的理想系统。v原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的 前提。v分离的原生质体活性受供体材料和分离条件 的影响。v原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技 术成熟程度直接影响体系的应用。小结v原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。v体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创 造中具有深远意义。v原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合v提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技 术研究的重点思考题1原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原 生质球的概念。 2为什么原生质体要培养在等渗培养基中？ 3影响原生质体培养的主要因素。 4原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点 5为什么说原生