致泻大肠埃希氏菌肠出血性大肠杆菌O157 ：H7食品微生物国际标准和现代快速检测方法培训王王 金金 玲玲 博博 士士 TelTel：1380499297713804992977 024-24810792024-24810792enterovirulent Escherichia coli & Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 一、概念及分类地位二、生物学特性三、卫生学意义四、检测方法五、希望内容提要一 概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌（enterovirulent E. coli ）：大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多 不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。某 些血清型菌株的致病性强，可引起腹泻等疾病 的一群大肠杆菌。一 概念及分类地位埃希氏菌属大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌肠道致病性大肠埃希氏菌 EPEC肠道出血性大肠埃希氏菌EHEC产肠毒素大肠 埃希氏菌ETEC肠道侵袭性大肠埃希氏菌EIEC肠杆菌科一 概念及分类地位致泻大肠埃希氏菌肠致病性大肠杆菌（EPEC）：是婴儿腹泻的 主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死； 成人少见。 肠出血性大肠杆菌（EHEC）：引起散发性或 暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细 胞毒素。 肠产毒性大肠杆菌（ETEC）：引起婴幼儿和 旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍 乱样症状。 EIEC 引起痢疾样的腹泻和脓血便，有的并引 起较大规模的食物中毒、医院内感染或水源性 腹泻的爆发。 肠出血性大肠杆菌（EHEC）：l987年由Levine提出，是能引起人的出血 性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以 O157：H7血清型为代表菌株。EHEC O157： H7感染可引起程度不同腹泻、出血性结肠 炎（HC）、肾溶血性尿毒综合征（HUS） 、血栓性血小板减少性紫癜（TIP）等。 其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃 至死亡。二 生物学特性革兰氏染色阴性、两端钝圆的短小杆菌，一般大小约 0.5m0.8m1.0m3.0m，因生长条件不同，个别菌体可呈近似 球状或长丝状。多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50% 左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有14根，一般不 超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数 量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱 性染料着色良好。 在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温 度为37，在4244条件下仍能生长，生长温度范围为1546 。 对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在 室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但 将37降至4过程中， 30分钟可杀死此菌。加热60， 30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水 中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗 煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用 此菌这一性质。 EHEC O157：H7其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性，即O157：NM。EHEC O157：H7具有 较强的耐酸性，pH 2.53.0，37可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长 期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，751分钟即被灭 活；对氯敏感，可被1mg/L的余氯浓度杀灭。适宜生长温度为3342，37繁殖迅速，4445生长不良，45.5t停 止生长。除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基 本相似，EHEC O157：H7虽然有uidA基因，但其编码的葡萄糖醛酸酶 无活性，不能分解4甲基伞形酮D葡糖糖醛酸苷（MUG）产生荧 光，即MUG阴性。三 卫生学意义在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标 是国际上公认的卫生监测指示菌 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标 多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性 致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上 近来，国家质检总局从美国进口的鸡腿中多次检出O157：H7型大肠杆菌 ，并将其销毁处理。鉴于出血性大肠杆菌O157：H7对食品卫生的重要性，世界卫生组织于 1997年4月- 5月召开专家会议，讨论防制措施，提出将汉堡包、碎牛肉 、生乳、苹果汁、酸奶、奶酪和发酵香肠等列为重点注意的食品。1982年在美国首次发现O157：H7型大肠杆菌 。此后，在美国、英国、加拿大、澳大利亚接 连不断发生。1993年美国发生了700人感染的 暴发流行。至今美国共暴发流行60多起，每年 约2万人感染。1996年夏天，日本这个号称世 界上最干净的国家里暴发由O157：H7型大肠杆 菌污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事 件，波及东京、大阪、京都等40多个府县，患 者累计达9000余人，7人死亡。肠产毒性 大肠杆菌肠致病性大肠杆菌 肠侵袭性 大肠杆菌肠出血性 大肠杆菌 感染 部位小肠小肠大肠大肠腹泻 类型水泻水泻痢疾样血性腹泻易感 人群婴儿，成人婴儿成人，儿童各种年龄分布发展中国家（ 热带）世界各地世界各地北美，日本流行 病学散发或暴发婴 儿腹泻及旅游 者腹泻散发或暴发婴儿腹泻散发或暴发，常见于 年龄较大儿童引起散发性 或暴发性出 血性结肠炎 致病 机理LT，ST 定居因子细胞毒素 定居因子侵袭肠粘膜细胞细胞毒素常见 O血清型6，8，15，20 ，25，27，78 ，148，1592，26，44，55，86，111 ，114，119，125，126， 127，128，142，146，158 28，29，112，124， 136，143，144，152 ，164，167 O157：H7，O157：NM鉴定测定LT、ST ，检出定居 因子血清型血清型与临床表现血清型测定细胞侵 袭力血清型四 检测方法1、致泻大肠埃希氏菌 经典培养生化鉴定法2、肠出血性大肠杆菌O157：H7 经典培养生化鉴定法显色培养筛选法 PCR方法实时PCR方法 VIDAS快速筛选法 BAX全自动PCR方法免疫磁珠富集方法 胶体金方法 由于传统经典检测方法的检测水平只能达到200cfu/g， 而食品、环境等样品中EHEC O157:H7含量较低，且该菌 的致病量为3cfu/g针对EHEC O157：H7的检测技术和方法不断改进和创新 ，现已研究建立 6-10 种检测方法。 1 致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法 ）1.1 增菌1.2 分离1.3 生化试验 1.4 血清学试验1.5 肠毒素试验 (略)1.6 结果报告非常 重要1 致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.1 增菌以无菌操作取检样25g（mL），加在225mL营养肉汤中，均质，取出适量， 接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内 ，于361培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于 42培养18h。1.2 分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝 琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝 平板，于361培养18h24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落 ，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。1.3 生化试验（1）接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）、蛋白胨水、半固 体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶，在36培养过夜。（2）TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培 养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性 的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 1 致泻大肠埃希氏菌（经典培养生化鉴定法）1.4 血清学试验假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致 病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多 价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一 种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如 与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland 3号比浊管相当 的浓度。原效价为（1:160）（1:320）的O血清，用0.5%盐水稀释 至1:40。稀释血清与抗原悬液在10mm75mm试管内等量混合，做单管 凝集试验。混匀后放于50水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝 集，可证实为该O抗原。1.5 肠毒素试验 1.6 结果报告: 综合生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告检测周期:4-6天，灵敏度差，易造成漏检2 肠出血性大肠杆菌O157：H7（经典培养生化鉴定法 ）检样25g 225mL m(EC)n肉汤增菌41 24h10-4、10-5、10-6三个稀释度0.1mL，涂布 SMAC（山梨醇麦康凯琼脂平板）37 24h挑取5-8个无色菌落转种MUG、LST发酵管培养基37、24h，挑阴 性培养物转种普通营养琼脂 可按仪器生产厂 说明采取；vidas 快速筛选法45min 可获初步结果阳性反应者作 进一步证实 生化反应鉴定血清凝集鉴定EHEC乳胶凝集试验或2 肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDAS快速筛选法 ） 检测原理VIDAS快速筛选检测EHEC O157：H7，是一种在自动VIDAS仪器上进行 的酶联荧光免疫分析（ELFA）方法。固相容器（SPR）：一个类似子 加样头样的一次性使用装置，在检测中起固相和加样器作用，SPR用 抗EHEC O157：H7抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。所有检测步骤均自动由VIDAS仪器完成煮沸过的增菌肉汤加入试条 孔后，在特定时间内，样品在SPR内、外反复循环。标记有碱性磷酸 酶的抗体也在SPR内、外循环并与固定在SPR壁上的EHEC O157：H7抗原 结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4 甲基伞形物。仍结合在SPR壁上的酶将崖化底物转变成具有荧光的产 物，4甲基伞形酮。在VIDAS中由光扫描器检测该荧光强度，试验完 成由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的实验报 告。2 肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDAS快速筛选法 ）样品制备225mL mEC+n中加入25克（25mL）样本；已加工的肉，向225mL mEC+n中加入50克样本，37振荡（120rpm）孵育24小时。 检测步骤（1）VIDAS EHEC O157：H7试剂盒恢复到室温（2）其余试剂放回28贮存。（3）标记（4）输入信息建立work list（5）将对照液或样品加入ECO试剂条样品孔中央（6）将ECO试剂条和EEO SPR放入VIDAS仪相应位置（7）根据VIDAS操作手册开始检测步骤。检测约需45分钟。（8）所有用过的SPRs和试条丢弃子适当容器。2 肠出血性大肠杆菌O157：H7 （VIDAS快速筛选法 ）结果判断每份样品有两个荧光读数，第一个数值表示SPR未加入底物时容器和底物的本底。第二个数值则表示SPR内面的酶复合物与底物反应后的结果，该数值 减去本底后则为相对荧光值（RFV）。检测值则是由每份样品的RVF与标准对照值相比得出的。从样品和对 照得出的检测值再与计算机存储的阈值比较。当检测结果阈值 0.10时,表示样品检测结果为阴性。当检测结果阈值0.10时,表示样品检测结果为阳性。 优点：快速性（1-2天）、特异性、准确性、灵敏性2 肠出血性大肠杆菌O157：H7（BAX全自动PCR方法）检测原理BAX EHEC O157：H7检测系统是应用多重PCR技术检测食品中的EHEC O157：H7的自动方法。自动化的BAX系统的检测对象是EHEC O157：H7特 有的一段DNA片段，此片段是稳定的