实验10 琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验原理DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟 DNA 几乎具有等量 净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小 和构型。一、实验原理具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动 速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系 。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但 构型不同的DNA 分子。二、实验仪器 1 恒温培养箱2 琼脂糖凝胶电泳系统3 台式离心机4 高压灭菌锅5 紫外线透射仪6 凝胶成像系统三、实验试剂Loading dye (0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液) 10ml需0.025g溴酚兰和4g蔗糖B：需1g溴化乙锭TBE：TBE贮液2L：108g Tris-base、55g硼酸、40ml 0.5M的EDTA(pH8.0)需7.4g disodium2H2O琼脂糖：30g四、实验步骤1 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好， 水平放置在工作台上； 2 调整好梳子的高度； 3 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在 微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50C时倒入制胶板中； 4 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；四、实验步骤5 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；DNA 5l + ddH2O 3l + 溴酚蓝2l 共10l于0.5ml tube 中混合后点样； 6 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核 酸样品向正极泳动； 7 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化 乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外 透射仪上观察电泳结果，并照相记录。五、主要事项1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：a DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基 对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重 复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的 电泳快（超螺旋线性DNA）b 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 胶浓度，U为迁移率 ，U0 为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质 阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb五、主要事项c DNA构象：一般迁移速率超螺旋环 状线状DNA单链开环。当条件变化时 ，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流 强度、离子强度及EB含量有关。d 所加电压：低电压时，线状DNA片 段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨 效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm五、主要事项e 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 f 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加 在电泳液中)g 电泳缓冲液（0.5TBE）的组成及其离子强度影响 DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强 度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用 1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。五、主要事项2 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应 戴手套，尽量减少台面污染。3 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂 有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb） 呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在 凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。六、思考题n1、DNA在电场中的迁移率取决于哪些因 素？ n2、琼脂糖凝胶有哪些注意事项？