以PU/PVA包埋菌體顆粒於氣舉式反應器中處理含甲 苯與乙酸乙酯廢氣之研究 第一年度：造成抑制現象的原因探討計畫編號：CHU-94-TR-05 主 持 人： 黃思蓴 教授 環境資源與能源科技研究所 參與人員： 張慧玫 助理教授 生物資訊系徐增興 助理教授 土木與工程資訊學系1.0 簡介 國內許多作業製程常用到大量的揮發性有機溶劑（VOCs），逸散所造 成之污染相當普遍，對於環境及人類會造成重大的衝擊。 對於含VOCs的廢氣，一般皆採用物理化學方法來處理，雖然處理效 果良好，但相對的處理成本較高且可能會產生二次污染的問題，所以 近年來以具低成本、高處理效率且無二次污染問題等優點的生物處理 法最具發展潛力。 就噴塗業來說，其製程中所產生之廢氣以甲苯和乙酸乙酯為主，而甲 苯和乙酸乙酯皆為高生物分解性之揮發性有機化合物，所以很適合用 生物濾床來處理 。本實驗室過去發現在高濃度乙酸乙酯存在下，甲苯 與二甲苯之去除會受到抑制而導致處理效果大幅下降。 本研究首先想了解噴塗業所排放含甲苯和乙酸乙酯廢氣，在生物濾床 處理時所產生的抑制現象，並且進一步探討使用固定化後來，該抑制 現象是否能夠有效改善。2.0 材料與方法 菌株來源 Rhodococcus fascians AC6（只分解乙酸乙酯；中興李季眉教授） Rhodococcus sp.B5（可分解甲苯和乙酸乙酯；中興李季眉教授） Pseudomonas putida F1 ATCC 700007（只分解甲苯；新竹市食品所 BCRC）。 菌種保存方法為採用繼代培養方法與低溫保存方法。 繼代培養方法為將純菌以平板法培養，保存約1個月。藉由替換固 態培養皿，以重複進行培養達到菌種保存之目的。 低溫保存方法為將菌液與甘油（glycerol溶液濃度為20）以1：1 （v/v）混合注入2 ml之冷凍離心管中，並置入-20之低溫保存箱 中進行保存。2. 材料與方法 培養基 菌種的活化培養基為甲苯或乙酸乙酯等基質，以及酵母萃取液及豐味 通。工作培養基則如表1所示。 氣相甲苯及乙酸乙酯分析 以氣密針筒抽取0.5 ml待測氣體樣品，注入氣相色層分析儀（GC/FID ）中。 氣相層析儀（GC/FID）的操作條件 ，使用管柱：J&W, DB-5 融合矽膠 毛細管柱，長30m, 內徑0.53mm ID ，吸附膜為5.0 m。操作溫度依序 為：管柱加熱器：120 oC, 注射器： 210 oC, 偵測器：230 oC。表1 HCMM2培養基組成 (Ridgway et al., 1990)成分濃度KH2PO4 1.36(g/L) Na2HPO4 1.42(g/L) KNO3 0.50(g/L) (NH4)2SO4 2.38(g/L) MgSO47H2O0.05(g/L) CaCl2 0.01(g/L) H3BO32.86(mg/L) MnSO4H2O1.54(mg/L) Fe(NH4)2(SO4)26H2O3.53(mg/L) CuSO45H2O0.039 (mg/L) ZnCl2 0.021 (mg/L) CoCl26H2O0.041 (mg/L) Na2MoO42H2O0.025 (mg/L)2. 材料與方法 菌量測定方法 (1) 光學密度測量法 菌體量測定方法為濁度測定法（optical density，O.D.），利用波長為 600 nm之分光光度計，測量待測樣品菌液之吸光度（O.D.600），並 以培養液的上澄液校正之。樣品經過稀釋後之光學密度讀值需達0.5以 下，方可進行測量。 (2) 蛋白質分析方法 蛋白質的測定採BCA測定法（BCA Protein Assay）（Pierce chemical company, 1997），可測定的蛋白質濃度範圍為202,000g/mL。 BCA分析試劑包括A、B兩試劑及2.0 mg / ml Albumin standard。將A 與B試劑以50：1（v/v）的方式均勻混合作為Working Solution，有效 保存期限為24小時。 取0.1 ml的蛋白質標準試劑或樣品，加入2 ml的Working Solution，置 於37水浴槽中反應30分鐘後靜置至室溫，再以分光光度計於波長562 nm下量測其吸光度（O.D.562）。3.1 單一菌株分解甲苯及乙酸乙酯的能力及最佳的成長條件 最佳培養條件 20%的植種率、pH 7、28 oC 菌株分解能力 就乙酸乙酯而言，菌株AC6的 分解能力明顯優於菌株B5 就甲苯而言，菌種B5的分解能 力些微優於菌株F1。 而當甲苯及乙酸乙酯的負荷增 加時，每一種菌株分解有機物 所需的時間都明顯增加，但是 仍然在可以分解的範圍之下。 圖1、在相同T/E比，但增加VOC的負荷下，各種菌株生物分解甲苯與乙酸乙酯的情形：菌株AC6 (a)、菌株B5 (b,c)及菌株F1 (d)。註：菌株AC6 不能分解甲苯，而菌株F1 不能分解甲苯。3.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機 物的影響 懸浮菌株降解95%甲苯所需時間 各獨立菌株皆因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，需要更多的時間來 分解甲苯；即使是也是如此。 混合菌株所需的時間卻因為混合而造成嚴重的延遲；而且是愈高負荷 ，影響愈大。按推論，這是群族之間競爭的結果；而菌株AC6和B5對 此效應比較輕微。 依據（Hwang et al., 2003），得知菌株AC6在某些條件下，的確可以 幫助菌株B5快速分 解乙酸乙酯，而讓 菌株B5可以更專一 地去分解甲苯，在 生態學上形成了互 助的效應。 表2 在懸浮狀態下，同T/E比但增加負荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC6 & F1) 而能達到95%甲苯去除率所需的時間T/E比懸浮菌株降解95%的甲苯所需的時間 (h)菌株B5菌株F1AC6+B5B5+F1AC6+F12:286810104:4881010108:810101412:12141216:161818: 需要大於24 h以上的時間來分解3.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機 物的影響 懸浮菌株降解95%乙酸乙酯所需時間 各獨立菌株也會因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，而些微增加所需 要的時間來有效分解乙酸乙酯；即使是混合菌株也是如此。 混合菌株所需的時間卻只有在菌株B5和F1的組合下，才會造成嚴重的 延遲，其他並不會太嚴重。 按推論，這也是群族之間競爭的結果；而菌株B5和F1因為使用相同的 甲苯做為碳源，且 效率相當，所以彼 此之間有較嚴重的 抑制現象。 表3 在懸浮狀態下，同T/E比但增加負荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC6 & F1) 而能達到95%乙酸乙酯去除率所需的時間T/E比懸浮菌株降解95%的乙酸乙酯所需的時間 (h)菌株AC6菌株B5AC6+B5B5+F1AC6+F12:2222424:4222428:82446412:122448416:16464843.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機 物的影響 微生物固定化後對有機物分解 的影響 由圖2(a)、2(b)的比較，得知在微生物 固定化之後，分解甲苯所需的時間， 亦隨有機物的負荷增加而些微增加； 但所需要的時間不再為無限長。 至於乙酸乙酯，亦可見微生物固定化 的幫助，但是沒有對甲苯顯著。 由於固定化的作法是將各菌株以固定 的空間隔離開來，在理論上是不會有 族群競爭的問題存在。圖2、在相同T/E比，但增加VOC的負荷下，各種菌群以懸浮 (a,c) 的或是固定化(b,d) 的型 式來分解甲苯 (a, b) 與乙酸乙酯 (c,d) 時，去除率達95%所需的時間：菌群AC6 & B5 ( ) 、菌群B5 & F1 ( )及菌群AC6 & F1 ( )。3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對 混合菌株分解甲苯的影響 懸浮菌株降解95%甲苯所需時間 各獨立菌株在輕負荷時，皆因為甲苯的量固定，並不會隨乙酸乙酯的 添加量增加，而需要更多的時間來分解甲苯。混合菌株卻會因乙酸乙 酯添加量增加而增加分解甲苯所需的時間。 這說明固定量的甲苯受到乙酸乙酯增加的間接效應而增加所需的時間 ，例如，菌株B5和F1的組合最為嚴重（基質競爭衍生的族群競爭）。 菌株AC6和F1在乙酸乙酯的負荷較輕微時，因為沒有共同的基質，各 菌株可以專一地進行 甲苯或乙酸乙酯的分 解；但在高負荷時， 可能溶氧不足，而抑 制。 表4 在懸浮狀態下，以固定甲苯添加量（4 l）下增加乙酸乙酯添加量 (不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達到95%甲苯去除率所需的時間T/E比懸浮菌株降解95%的甲苯所需的時間 (h)菌株B5菌株F1AC6+B5B5+F1AC6+F14:01012121084:41010121484:810121218104:1212101420144:1614101422143.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對 混合菌株分解甲苯的影響 微生物固定化後對有機物分 解的影響 由圖3(a)、2(b)的比較，得知固定 化菌體顆粒，分解固定量甲苯所需 的時間，並不太會隨有機物的負荷 增加而增加。 菌株B5和F1在固定化之後，可以 有效地改善其原先在懸浮狀態下分 解時間嚴重落後的現象。 由於固定化的作法，在理論上是不 會有族群競爭的問題存在。由此可 見，之前推論的基質抑制所衍生的 族群競爭是正確的。 圖3、在固定甲苯添加量 (4-l) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮 (a) 的或是固定化(b) 的型式來分解甲苯時，去除率達95% 所需的時間：菌群AC6 & B5 (square )、菌群B5 & F1 (circle )及菌群AC6 & F1 (triangle )。3.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯 對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 懸浮菌株降解95%乙酸乙酯所需時間 由表中得知各獨立菌株皆因為乙酸乙酯的量固定，並不會隨甲苯的添 加量而增加，而需要更多的時間來分解乙酸乙酯；但是混合菌株B5和 F1卻會因甲苯的量增加而增加分解乙酸乙酯所需的時間。 由於甲苯量的增加，對於乙酸乙酯的分解時間沒有改變，這說明在此 基質抑制的效應是不存在的。由於這次又以菌株B5和F1的組合所受到 的抑制最為嚴重，由此可見他們在生態學上形成互斥的效應。 表5 在懸浮狀態下，以固定乙酸乙酯添加量（4 l）下增加甲苯添加量 (不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合 (strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達到95%乙酸乙酯去除率所需的時間T/E比懸浮菌株降解95%的乙酸乙酯所需的時間 (h)菌株AC6菌株B5AC6+B5B5+F1AC6+F10:4222624:4222628:42226212:42226216:4224643.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯 對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 微生物固定化後對有機物分解的影響 由圖4(a)、2(b)的比較，得知在 微生物固定化之後，分解固定 量乙酸乙酯所需的時間，並不 太會隨甲苯添加量的增加而增 加。 菌株B5和F1在固定化之後，可 以有效地改善其原先在懸浮狀 態下分解時間嚴重落後的現象 。圖4、在固定乙酸乙酯添加量 (4-l) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮 (a) 的或是固定化(b) 的型式來分解乙酸乙酯時， 去除率達95%所需的時間：菌群AC6