临床检验诊断学专业优秀论文临床检验诊断学专业优秀论文 FOXO1FOXO1 转录因子在胰岛转录因子在胰岛 细胞中的细胞中的作用及机制研究作用及机制研究关键词：胰岛关键词：胰岛 细胞细胞 基因芯片基因芯片 转录因子转录因子 2 2 型糖尿病型糖尿病 内分泌细胞内分泌细胞 蛋白表达蛋白表达 分子机制分子机制摘要：2 型糖尿病(T2DM)是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，胰岛素抵抗 和胰岛 细胞功能受损是。T2DM 发病的中心环节1。胰岛 细胞是机体胰 岛素的唯一内分泌细胞，其数量、体积及功能状态决定了胰岛素的分泌水平， 对维持血糖恒定起重要作用1。胰岛 细胞数量的维持主要取决于 细胞新 生、增殖、肥大及凋亡之间的动态平衡。T2DM 患者， 细胞数量显著低于非糖 尿病者，最终导致胰岛素分泌量不足，其机体能量代谢障碍，但其发生机制尚 未完全阐明2-5。 FOXO1 是调节细胞氧化应激反应及增殖、凋亡的重要转 录因子，广泛表达于糖、脂代谢的重要器官，如肝脏、脂肪和骨骼肌等6-7。 最近研究显示 FOXO1 亦表达在成人胰岛中，Guerra 等8从 13 例人的组织标本 中报道，2 型糖尿病人的胰岛中 FOXO1 的 mRNA 表达量显著高于非糖尿病对照组， 提示高表达 FOXO1 可能造成 细胞功能损伤。然而，对 FOXO1 在成熟 细胞 中的作用尚不清楚。为此，本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察 FOXO1 在胰岛的表达及细胞定位；通过病毒介导的基因转移技术和 siRNA 干预 技术，在培养的大鼠胰腺癌 细胞系(INS-1E)中特异高表达组成性活性的 FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平，观察 FOXO1 表达水平的改变对 细胞增 殖、凋亡的影响；进一步采用基因芯片技术分析了 INS-1E 中受 FOXO1 调控的下 游靶基因，并对其功能进行了初步的分析预测。具体的研究工作如下： 1.首 先观察了 FOXO1 在成年 SD 大鼠胰腺中的表达及分布：4-6 月成年 SD 大鼠胰腺 进行冰冻切片免疫组化分析，结果显示 FOXO1 特异性表达在胰腺的胰岛组织中。 为了进一步确定 FOXO1 在胰岛组织中的细胞定位，采用免疫荧光标记观察不同 荧光标记的 FOXO1(绿色)和胰岛素(红色)在胰岛中的分布，激光共聚焦观察发 现绝大多数 FOXO1 蛋白与胰岛素的定位一致(橙色)，表明 FOXO1 在生理情况下 主要高表达在分泌胰岛素的 细胞中。 2.为了阐明 FOXO1 在成熟胰岛 细 胞中的作用，我们首先构建了高表达 FOXO1 的腺病毒载体：利用基因同源重组 原理，通过复制缺陷型 pAdEasy 腺病毒系统构建了磷酸化位点突变的具有组成 活性的全长 FOXO1(T24AS256AS319A)重组腺病毒，纯化后病毒滴度约为 51012U/ml。病毒感染肝癌细胞系 HepG2，通过观察 GFP 荧光、Western blot 等方法证明 Ad-FOXO1-AAA 重组腺病毒能有效的介导 FOXO1 蛋白的表达，经灰度 扫描及定量分析发现使 FOXO1 蛋白表达水平升高 9.8 倍。 3.为了比较内源性 FOXO1 蛋白表达水平降低对成熟 细胞功能的影响，我们构建了针对 FOXO1 的 siRNA 腺病毒载体：利用 WWW.ambion.com 网站在线设计，并辅助设计软件，选 择了三个针对 FOXO1 的 siRNA 位点，分别为 si-FOXO1-1、si-FOXO1-2 和 si- FOXO1-3；一个针对 FOXO1 和 FOXO3 同源序列的 siRNA 位点，命名为 si-FOXO- pan；以及一个不针对任何基因的随机序列作为阴性对照。人工合成 si-FOXO1s 的 cDNA 序列，退火形成的双链 cDNA 克隆到腺病毒表达载体 pAdTrack-CMV 上， 经 PmeI 线性化后与 pAdEasy-1 细胞内同源重组，最后在 HEK293 细胞中包装为 重组腺病毒，分别命名为 Ad-si-FOXO1-1、Ad-si-FOXO1-2、Ad-si-FOXO1-3、Ad-si-FOXO-pan 和 Ad-NC。扩增后测定病毒滴度均约为 510122U/ml。重 组腺病毒感染肝癌细胞系 HepG2，Western blot 检测结果显示，重组腺病毒能 有效的抑制 FOXO1 蛋白的表达，经灰度扫描及定量分析发现抑制效果达 45- 65，其中 si-FOXO1-3 的抑制效果最显著，达到 65。 4.为了确定 FOXO1 表达降低是否影响其转录功能，选取了 FOXO1 的靶基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激 酶(PEPCK)，检测 si-FOXO1s 对其启动子转录活性的影响：提取 HepG2 基因组 DNA，PCR 扩增得到 PEPCK 基因长约 592bp 的 5侧翼区启动子序列，插入 pGL3-Basic 荧光素报告质粒中。加入 Ad-si-FOXO1s 重组腺病毒感染 HepG2 细 胞后，检测 si-FOXO1s 对 PEPCK 启动子转录活性的影响，结果显示，与阴性对 照 si-NC 相比，si-FOXO1s 显著降低 PEPCK 启动子的荧光素酶活性，其中 Ad- si-FOXO1-1 降低 40，Ad-si-FOXO1-2 降低 55，Ad-si-FOXO1-3 降低 67，Ad-si-FOXO-pan 降低 68，表明构建的 Ad-si-FOXO1s 能显著抑制 FOXO1 靶基因的表达，具有功能活性。si-FOXO1-3 抑制蛋白表达最低，抑制后 FOXO1 的功能活性也最低，所以后续实验均选择 si-FOXO1-3。 5.为了观察 FOXO1 表达水平的改变对胰岛 细胞功能的影响，首先检测 si-FOXO1 和 FOXO1-AAA 重组腺病毒能否有效的下调或上调胰腺癌 细胞系中 FOXO1 表达水 平：将 Ad-si-NC、Ad-si-FOXO1-3 和 Ad-FOXO1-AAA 腺病毒感染胰腺癌 细胞 系 INS-1E，发现有明显绿色荧光表达，进一步采用 Western Blot 分析各组细 胞中 FOXO1 蛋白质的表达水平，经扫描及定量分析发现 Ad-si-FOXO1 对 FOXO1 的表达抑制达 74，FOXO1-AAA 导入细胞内使 FOXO1 表达升高 8.7 倍。 6.采 用 3H-TdR 掺入实验观察 FOXO1 表达水平的改变对胰岛 细胞增殖的影响，结 果显示，降低 FOXO1 的表达显著促进了 细胞的增殖，而高表达 FOXO1 则显著 抑制了 细胞的增殖；与之相应，MTT 检测结果显示，降低 FOXO1 的表达对 细胞存活有显著促进作用，高表达 FOXO1 对 细胞存活有显著抑制作用； 进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示降低 FOXO1 的表达使 细胞凋 亡率降低，反之高表达 FOXO1 使 细胞凋亡率增加。采用放射免疫法检测感染 重组腺病毒后 INS-1E 细胞胰岛素的分泌情况，实验结果显示，FOXO1 表达水平 的改变对胰腺癌 细胞系 INS-1E 的胰岛素分泌没有显著影响。 7.为了深入 揭示 FOXO1 在胰岛 细胞中的作用机制，我们进一步采用基因芯片技术研究受 FOXO1 调节的下游靶基因表达变化情况：提取 Ad-si-NC 和 Ad-FOXO1-AAA 重组 腺病毒感染的胰腺癌 细胞系 INS-1E 的总 RNA，纯化后制成 cDNA 探针，与 Agilent 大鼠全基因组芯片杂交，经过信号检测、微阵列图像分析、计算机软 件数据处理，将所得的数据进行比较，筛选出差异表达基因。结果显示，INS- 1E 细胞中高表达 FOXO1 与对照组有显著差异(基因表达水平差异gt;2 为显 著升高，lt;0.5 为显著降低)的基因 254 条，其中表达序列标签 (eXpressed sequence taq，EST)有 107 条，全长基因有 147 个。表达上调的基 因有 135 个，表达下调的基因有 12 个。分析其功能后，从差异表达基因中初步 筛选出参与调节细胞增殖、凋亡的基因 16 个。 本研究显示在 SD 大鼠的胰岛 中，FOXO1 主要高表达在分泌胰岛素的胰岛 细胞中；在培养的胰腺癌 细 胞中初步证实，FOXO1 转录因子表达水平的变化对分化成熟的 细胞的增殖及 凋亡具有调节作用，高表达 FOXO1 显著抑制了 细胞的增殖，同时使 细胞 凋亡率增加，对胰岛 细胞分泌胰岛素的能力没有显著影响；通过基因芯片初 步筛选出了受 FOXO1 调控的与细胞增殖和凋亡相关的基因。这些结果为深入揭 示 FOXO1 调节 细胞的增殖及凋亡的分子机制奠定了基础，为揭示 2 型糖尿病发生发展中 细胞代偿性增生受损的发生机制提供了重要的线索。正文内容正文内容2 型糖尿病(T2DM)是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，胰岛素抵抗和 胰岛 细胞功能受损是。T2DM 发病的中心环节1。胰岛 细胞是机体胰岛 素的唯一内分泌细胞，其数量、体积及功能状态决定了胰岛素的分泌水平，对 维持血糖恒定起重要作用1。胰岛 细胞数量的维持主要取决于 细胞新生、 增殖、肥大及凋亡之间的动态平衡。T2DM 患者， 细胞数量显著低于非糖尿病 者，最终导致胰岛素分泌量不足，其机体能量代谢障碍，但其发生机制尚未完 全阐明2-5。 FOXO1 是调节细胞氧化应激反应及增殖、凋亡的重要转录因 子，广泛表达于糖、脂代谢的重要器官，如肝脏、脂肪和骨骼肌等6-7。最近 研究显示 FOXO1 亦表达在成人胰岛中，Guerra 等8从 13 例人的组织标本中报 道，2 型糖尿病人的胰岛中 FOXO1 的 mRNA 表达量显著高于非糖尿病对照组，提 示高表达 FOXO1 可能造成 细胞功能损伤。然而，对 FOXO1 在成熟 细胞中 的作用尚不清楚。为此，本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察 FOXO1 在胰岛的表达及细胞定位；通过病毒介导的基因转移技术和 siRNA 干预 技术，在培养的大鼠胰腺癌 细胞系(INS-1E)中特异高表达组成性活性的 FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平，观察 FOXO1 表达水平的改变对 细胞增 殖、凋亡的影响；进一步采用基因芯片技术分析了 INS-1E 中受 FOXO1 调控的下 游靶基因，并对其功能进行了初步的分析预测。具体的研究工作如下： 1.首 先观察了 FOXO1 在成年 SD 大鼠胰腺中的表达及分布：4-6 月成年 SD 大鼠胰腺 进行冰冻切片免疫组化分析，结果显示 FOXO1 特异性表达在胰腺的胰岛组织中。 为了进一步确定 FOXO1 在胰岛组织中的细胞定位，采用免疫荧光标记观察不同 荧光标记的 FOXO1(绿色)和胰岛素(红色)在胰岛中的分布，激光共聚焦观察发 现绝大多数 FOXO1 蛋白与胰岛素的定位一致(橙色)，表明 FOXO1 在生理情况下 主要高表达在分泌胰岛素的 细胞中。 2.为了阐明 FOXO1 在成熟胰岛 细 胞中的作用，我们首先构建了高表达 FOXO1 的腺病毒载体：利用基因同源重组 原理，通过复制缺陷型 pAdEasy 腺病毒系统构建了磷酸化位点突变的具有组成 活性的全长 FOXO1(T24AS256AS319A)重组腺病毒，纯化后病毒滴度约为 51012U/ml。病毒感染肝癌细胞系 HepG2，通过观察 GFP 荧光、Western blot 等方法证明 Ad-FOXO1-AAA 重组腺病毒能有效的介导 FOXO1 蛋白的表达，经灰度 扫描及定量分析发现使 FOXO1 蛋白表达水平升高 9.8 倍。 3.为了比较