老年医学专业毕业论文老年医学专业毕业论文 精品论文精品论文 人醛糖还原酶基因真核细胞人醛糖还原酶基因真核细胞表达模型的构建及中草药醛糖还原酶抑制剂筛选表达模型的构建及中草药醛糖还原酶抑制剂筛选关键词：醛糖还原酶基因关键词：醛糖还原酶基因 真核细胞真核细胞 中草药醛糖还原酶抑制剂中草药醛糖还原酶抑制剂摘要：糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病 变过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干 预 DCC 的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被 认为是 DCC 的主要发病机制之一(附录 1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR) 为 PP 的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR 抑制剂 (Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善 PP 代谢异常，预防与延缓 DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的 ARI 低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的 ARI，对 DCC 的预防和治疗具有重要的意义。中草药 ARI 作为天然产物，无明显不良反 应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制 AR，降血糖，抗氧化， 扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗 DCC 方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因 AR 及携带绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因 AR：GFP 导入真核细胞(酵母细 胞/HEK293 细胞)，构建 AR 表达的蛋白分子模型和 AR：GFP 的细胞模型，研 究 AR 在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初 步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR 基因酵母细胞表达模型的构建： 将含人 AR 基因的酵母重组质粒 pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期 构建并保存)，转化酵母宿主菌 INVSC1，分别命名为 XAR、XAG 菌株。加入 CuSO4(记为 0hr)诱导目的蛋白表达，通过 Northernblot、Westernblot，紫外 分光光度法检测 AR、AR：GFP 的基因表达、蛋白表达及 AR 酶活性。结果显示 AR 酵母蛋白分子模型成功建立：AR 细胞模型 XAR 菌株中 AR 的 mRNA 和蛋白均表 达较好，AR 活性较强(最高约为 140U/g)；XAG 菌株检测到 AR：GFP 的 mRNA 和蛋白较好表达，但融合蛋白 AR：GFP 几乎无 AR 活性。 (2)AR 基因 HEK293 细胞表达模型的构建：将目的基因 AR，AR：GFP 重组克隆到真核表达 载体 pcDNA3.1/myc-HisA 中，分别构建重组质粒 pHAR、pHAG，瞬时转染 HEK293 细胞，通过 Westernblot、紫外分光光度法观察 AR 和 AR：GFP 在 HEK293 细 胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示 AR 基因的 HEK293 细胞蛋白分子模型成功构建，基于 GFP 探针的 AR：GFP 细胞模型不太 理想。并借助 His 标签应用 Ni-NTA 磁珠得到纯化 AR 蛋白。 (3)中草药 ARI 的初步筛选：选用经典的 ARISorbinil 和 Zopolrestat 分别对上述两个蛋白分 子模型表达的细胞总蛋白 AR 活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明： 抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对 HEK293 细胞中 AR 的抑制效果更佳。随 选用 HEK293 细胞蛋白分子模型进行中草药 ARI 的初步筛选，筛选出具有潜在 ARI 作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖 JM 等，其 AR 抑制活性与 经典的 ARISorbinil 基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过 AR 靶点，成功地构建了 AR 基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293 细胞)蛋白分子表 达模型；借助 GFP 这一生物活分子探针，建立 AR：GFP 的细胞模型有待于进 一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药 ARI 的简单经济高效筛选，初步筛选出可能具有潜在的防治 DCC 的几种中草药 ARI。此 AR 蛋白分子模型靶点明确， 在中药 ARI 筛选方面可以发挥积极的作用。正文内容正文内容糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变 过程，需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预 DCC 的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认 为是 DCC 的主要发病机制之一(附录 1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为 PP 的主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR 抑制剂 (Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善 PP 代谢异常，预防与延缓 DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的 ARI 低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的 ARI，对 DCC 的预防和治疗具有重要的意义。中草药 ARI 作为天然产物，无明显不良反 应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制 AR，降血糖，抗氧化， 扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗 DCC 方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因 AR 及携带绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因 AR：GFP 导入真核细胞(酵母细 胞/HEK293 细胞)，构建 AR 表达的蛋白分子模型和 AR：GFP 的细胞模型，研 究 AR 在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初 步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR 基因酵母细胞表达模型的构建： 将含人 AR 基因的酵母重组质粒 pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期 构建并保存)，转化酵母宿主菌 INVSC1，分别命名为 XAR、XAG 菌株。加入 CuSO4(记为 0hr)诱导目的蛋白表达，通过 Northernblot、Westernblot，紫外 分光光度法检测 AR、AR：GFP 的基因表达、蛋白表达及 AR 酶活性。结果显示 AR 酵母蛋白分子模型成功建立：AR 细胞模型 XAR 菌株中 AR 的 mRNA 和蛋白均表 达较好，AR 活性较强(最高约为 140U/g)；XAG 菌株检测到 AR：GFP 的 mRNA 和蛋白较好表达，但融合蛋白 AR：GFP 几乎无 AR 活性。 (2)AR 基因 HEK293 细胞表达模型的构建：将目的基因 AR，AR：GFP 重组克隆到真核表达 载体 pcDNA3.1/myc-HisA 中，分别构建重组质粒 pHAR、pHAG，瞬时转染 HEK293 细胞，通过 Westernblot、紫外分光光度法观察 AR 和 AR：GFP 在 HEK293 细 胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示 AR 基因的 HEK293 细胞蛋白分子模型成功构建，基于 GFP 探针的 AR：GFP 细胞模型不太 理想。并借助 His 标签应用 Ni-NTA 磁珠得到纯化 AR 蛋白。 (3)中草药 ARI 的初步筛选：选用经典的 ARISorbinil 和 Zopolrestat 分别对上述两个蛋白分 子模型表达的细胞总蛋白 AR 活性进行抑制观察，两药物的抑制结果一致表明： 抑制效果呈药物浓度依赖性关系，但对 HEK293 细胞中 AR 的抑制效果更佳。随 选用 HEK293 细胞蛋白分子模型进行中草药 ARI 的初步筛选，筛选出具有潜在 ARI 作用的中药有效成分黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖 JM 等，其 AR 抑制活性与 经典的 ARISorbinil 基本相当，为进一步实验研究奠定基础。 本研究通过 AR 靶点，成功地构建了 AR 基因的真核细胞(酵母细胞/HEK293 细胞)蛋白分子表 达模型；借助 GFP 这一生物活分子探针，建立 AR：GFP 的细胞模型有待于进 一步改进。将蛋白分子模型应用于中草药 ARI 的简单经济高效筛选，初步筛选 出可能具有潜在的防治 DCC 的几种中草药 ARI。此 AR 蛋白分子模型靶点明确， 在中药 ARI 筛选方面可以发挥积极的作用。 糖尿病慢性并发症(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一个慢性病变过程， 需要长期用药，因而选择疗效确切、靶点清楚、副作用小的药物来干预 DCC 的发展，临床意义较大。糖代谢多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被认为是 DCC 的主要发病机制之一(附录 1)，醛糖还原酶(Aldosereductase，AR)为 PP 的 主要限速酶。体外研究和动物实验表明：AR 抑制剂 (Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善 PP 代谢异常，预防与延缓 DCC，如眼部病变、肾脏病变、神经病变。多数前期临床资料显示：人工合成的 ARI 低剂量疗效欠佳，高剂量副作用较大。因此寻找并筛选低毒高效的 ARI，对 DCC 的预防和治疗具有重要的意义。中草药 ARI 作为天然产物，无明显不良反 应，并可经过辨证施治，正确组方研制复方制剂，使抑制 AR，降血糖，抗氧化， 扩血管等多种功能并存，因而在预防治疗 DCC 方面显示了良好的应用前景。 本研究是利用基因重组和基因转导技术，将基因 AR 及携带绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因 AR：GFP 导入真核细胞(酵母细 胞/HEK293 细胞)，构建 AR 表达的蛋白分子模型和 AR：GFP 的细胞模型，研 究 AR 在代谢中的地位，并应用该模型进行中草药醛糖还原酶抑制剂(ARI)的初 步筛选。 研究分为以下三个部分： (1)AR 基因酵母细胞表达模型的构建： 将含人 AR 基因的酵母重组质粒 pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期 构建并保存)，转化酵母宿主菌 INVSC1，分别命名为 XAR、XAG 菌株。加入 CuSO4(记为 0hr)诱导目的蛋白表达，通过 Northernblot、Westernblot，紫外 分光光度法检测 AR、AR：GFP 的基因表达、蛋白表达及 AR 酶活性。结果显示 AR 酵母蛋白分子模型成功建立：AR 细胞模型 XAR 菌株中 AR 的 mRNA 和蛋白均表 达较好，AR 活性较强(最高约为 140U/g)；XAG 菌株检测到 AR：GFP 的 mRNA 和蛋白较好表达，但融合蛋白 AR：GFP 几乎无 AR 活性。 (2)AR 基因 HEK293 细胞表达模型的构建：将目的基因 AR，AR：GFP 重组克隆到真核表达 载体 pcDNA3.1/myc-HisA 中，分别构建重组质粒 pHAR、pHAG，瞬时转染 HEK293 细胞，通过 Westernblot、紫外分光光度法观察 AR 和 AR：GFP 在 HEK293 细 胞中的表达情况，实验结果与酵母细胞部分基本一致。结果显示 AR 基因的 HEK293 细胞蛋白分子模型成功构建，基于 GFP 探针的 AR：GFP 细胞模型不太 理想。并借助 His 标签应用 Ni-NTA 磁珠得到纯化 AR 蛋白。 (3)中草药 ARI 的初步筛选：选用经典的 ARISorbinil 和 Zopolrestat 分别对上述两个蛋白分 子模型表达的细胞总蛋白 AR 活性进行抑制观察，