内科学内科学( (血液学血液学) )专业优秀论文专业优秀论文 伴有红细胞和血小板异常的植物固伴有红细胞和血小板异常的植物固醇血症临床及发病机制的研究醇血症临床及发病机制的研究关键词：植物固醇血症关键词：植物固醇血症 红细胞形状红细胞形状 巨大血小板减少巨大血小板减少 基因突变基因突变 发病机制发病机制 高效高效 液相色谱液相色谱摘要：巨大血小板病（giant platelet disorders，GPD）是一组异质性疾病， 表现为血小板减少，巨大血小板和不同程度的出血。近年来，随着实验室检测 技术的进展，新的巨大血小板病不断地被发现，但至今还有相当多的病例不能 被分类和鉴定，易造成误诊。在临床实际工作中，我们发现一些巨大血小板病 不是血小板本身的病变，而是其它疾病的一种特殊表型。最近我们遇到了一种 罕见的病例，患者除表现巨大血小板减少外，还表现为红细胞异形、溶血性贫 血和血浆植物固醇明显增高。对这种伴有巨大血小板的特殊病例进行深入细致 的研究，有助于临床医生正确的认识此类疾病，及时地作出诊断、鉴别诊断和 治疗，并为将来的进一步研究提供理论基础。 目的：巨大血小板减少与溶血 性贫血共存在血液病中十分罕见，而且人们对其认识不清。一些血液病表现为 溶血性贫血伴血小板减少，如 Evan#39;s 综合征、血栓性血小板减少性紫 癜等，但它们的血小板体积不大。1969 年由 Ducrou 等提出的地中海口形红细 胞增多症/地中海巨大血小板减少症，临床上表现为口形红细胞增多性溶血性贫 血和巨大血小板，但仅见于澳大利亚的 Adelaide 地区，未见于其它地中海地区， 其病因和发病机制不清。1974 年 Bhaltacharyya 等首次报道了植物固醇血症 （又称 谷固醇血症） ，它是一种罕见的常染色体隐性遗传性脂质代谢性疾 病。特征是植物固醇特别是谷固醇在血液和组织中积聚，从而引起黄色瘤，早 发性冠心病、动脉硬化、关节炎等。2005 年 Rees 等首次报道了表现为口形红 细胞增多和巨大血小板的植物固醇血症。最近，我们发现了来自江苏盐城的一 个家庭的 3 个孩子自幼表现为溶血性贫血和巨大血小板减少，与地中海巨大血 小板减少症相似，但随着年龄的增长逐渐出现皮肤的黄色瘤。为了了解这种血 液学异常与植物固醇之间的关系，为了阐明此类疾病发生的分子机制以及将此 类疾病与其它巨大血小板病区别开来，我们对此家系的临床、生物化学和分子 生物学特征进行了研究。 方法：第 1 部分建立特异精确的血浆植物固醇测定 方法，以便植物固醇血症的诊断。制备谷固醇、豆固醇和二氢胆固醇标准溶液 及收集患者、他们父母和 10 名正常人非抗凝禁食血 2 ml。100l 血清或标准 溶液用 1 mol/L 氢氧化钾乙醇溶液皂化，正己烷溶液提取，苯甲酰氯溶液衍生。 衍生物再用正己烷溶液提取，然后在氮气流下挥发蒸干。非挥发物用 100l 四 氢呋喃：乙腈（1：1）溶解液溶解后，取 101 注入高效液相色谱（HPLC）进 行测定。HPLC 仪为美国 Agilent1100 系统，层析柱为 Diamonsil Ci8，流动相 为乙腈和异丙醇（75：25，v/v） ，流速为 1ml/min。在 235 nm 的波长下测定紫 外吸收值。第 2 部分分析一个植物固醇血症家系的临床特征。光学显微镜观察 红细胞和血小板形态。比浊法测定血小板聚集。流式细胞术检测血小板膜糖蛋 白（GP） 。PCR 法扩增 ABCG5 和 ABCG8 基因的所有外显子和侧翼序列，DNA 测序 确定基因异常，限制性内切酶（Bfa）分析该家系及 70 名正常人相应序列的 PCR 产物。第 3 部分用 HPLC 法检测 3 名患者、他们父母和 6 例正常人红细胞膜 的固醇含量。将谷固醇与红细胞在体外进行孵育，观察正常人红细胞形态变化并检测其渗透脆性。 结果：第 1 部分植物固醇血症患者血浆谷甾醇和豆甾醇 浓度明显高于正常人均值。他们父母的谷固醇和二氢胆固醇浓度比正常人均值 轻度增高，而豆固醇未见增高。第 2 部分 3 名患者临床上主要表现巨大血小板 和红细胞形态异常，如球形、口形红细胞和靶形细胞。红细胞渗透脆行增加。 出血时间延长、对瑞斯托霉素诱导聚集反应降低。他们血浆谷固醇、豆固醇和 二氢胆固醇浓度明显增高而总胆固醇浓度正常。发现在 ABCG5 基因外显子 1 中 18802 位碱基发生 CT 突变，导致 22 位的谷氨酰胺（Q）变为终止密码子。3 名患者均为纯合子，其父母及两个亲属为杂合子对 ABCG8 基因测序未见异常。 限制性内酶 Bfa分析 70 名正常人相应序列的 PCR 产物未发现相同的基因突变。 第 3 部分 3 名患者红细胞膜的谷固醇、豆固醇和二氢胆固醇浓度明显增高。谷 固醇与红细胞孵育后，红细胞异形明显，可见口形、球形红细胞和靶形细胞。 谷固醇组红细胞渗透脆性较对照组升高。 结论：1本研究采用改良的 HPLC 法对血浆植物固醇进行定量检测，该法具有简便快速，灵敏度高，需血样品量 小及分离效果好等优点，为植物固醇血症的诊断提供了一种切实可行的检测方 法。2血细胞是血浆植物固醇毒性作用的一个靶子；显著增高的血浆植物固醇 导致了红细胞和血小板的异常；红细胞和血小板的异常是植物固醇血症的一种 特殊的表型：伴有巨大血小板和（或）难以解释的溶血性贫血的患者需与植物 固醇血症鉴别。3ABCG5 基因外显子 1 上的一个新的无义突变构成了伴有红细 胞和血小板异常的植物固醇血症的分子基础。此突变是国际尚未报道的一个新 的突变。4植物固醇血症患者不仅血浆植物固醇含量增加，而且红细胞膜上的 植物固醇含量也增加；血浆植物固醇含量的增加对红细胞形态和渗透脆性有明 显的影响。正文内容正文内容巨大血小板病（giant platelet disorders，GPD）是一组异质性疾病，表 现为血小板减少，巨大血小板和不同程度的出血。近年来，随着实验室检测技 术的进展，新的巨大血小板病不断地被发现，但至今还有相当多的病例不能被 分类和鉴定，易造成误诊。在临床实际工作中，我们发现一些巨大血小板病不 是血小板本身的病变，而是其它疾病的一种特殊表型。最近我们遇到了一种罕 见的病例，患者除表现巨大血小板减少外，还表现为红细胞异形、溶血性贫血 和血浆植物固醇明显增高。对这种伴有巨大血小板的特殊病例进行深入细致的 研究，有助于临床医生正确的认识此类疾病，及时地作出诊断、鉴别诊断和治 疗，并为将来的进一步研究提供理论基础。 目的：巨大血小板减少与溶血性 贫血共存在血液病中十分罕见，而且人们对其认识不清。一些血液病表现为溶 血性贫血伴血小板减少，如 Evan#39;s 综合征、血栓性血小板减少性紫癜 等，但它们的血小板体积不大。1969 年由 Ducrou 等提出的地中海口形红细胞 增多症/地中海巨大血小板减少症，临床上表现为口形红细胞增多性溶血性贫血 和巨大血小板，但仅见于澳大利亚的 Adelaide 地区，未见于其它地中海地区， 其病因和发病机制不清。1974 年 Bhaltacharyya 等首次报道了植物固醇血症 （又称 谷固醇血症） ，它是一种罕见的常染色体隐性遗传性脂质代谢性疾 病。特征是植物固醇特别是谷固醇在血液和组织中积聚，从而引起黄色瘤，早 发性冠心病、动脉硬化、关节炎等。2005 年 Rees 等首次报道了表现为口形红 细胞增多和巨大血小板的植物固醇血症。最近，我们发现了来自江苏盐城的一 个家庭的 3 个孩子自幼表现为溶血性贫血和巨大血小板减少，与地中海巨大血 小板减少症相似，但随着年龄的增长逐渐出现皮肤的黄色瘤。为了了解这种血 液学异常与植物固醇之间的关系，为了阐明此类疾病发生的分子机制以及将此 类疾病与其它巨大血小板病区别开来，我们对此家系的临床、生物化学和分子 生物学特征进行了研究。 方法：第 1 部分建立特异精确的血浆植物固醇测定 方法，以便植物固醇血症的诊断。制备谷固醇、豆固醇和二氢胆固醇标准溶液 及收集患者、他们父母和 10 名正常人非抗凝禁食血 2 ml。100l 血清或标准 溶液用 1 mol/L 氢氧化钾乙醇溶液皂化，正己烷溶液提取，苯甲酰氯溶液衍生。 衍生物再用正己烷溶液提取，然后在氮气流下挥发蒸干。非挥发物用 100l 四 氢呋喃：乙腈（1：1）溶解液溶解后，取 101 注入高效液相色谱（HPLC）进 行测定。HPLC 仪为美国 Agilent1100 系统，层析柱为 Diamonsil Ci8，流动相 为乙腈和异丙醇（75：25，v/v） ，流速为 1ml/min。在 235 nm 的波长下测定紫 外吸收值。第 2 部分分析一个植物固醇血症家系的临床特征。光学显微镜观察 红细胞和血小板形态。比浊法测定血小板聚集。流式细胞术检测血小板膜糖蛋 白（GP） 。PCR 法扩增 ABCG5 和 ABCG8 基因的所有外显子和侧翼序列，DNA 测序 确定基因异常，限制性内切酶（Bfa）分析该家系及 70 名正常人相应序列的 PCR 产物。第 3 部分用 HPLC 法检测 3 名患者、他们父母和 6 例正常人红细胞膜 的固醇含量。将谷固醇与红细胞在体外进行孵育，观察正常人红细胞形态变化 并检测其渗透脆性。 结果：第 1 部分植物固醇血症患者血浆谷甾醇和豆甾醇 浓度明显高于正常人均值。他们父母的谷固醇和二氢胆固醇浓度比正常人均值 轻度增高，而豆固醇未见增高。第 2 部分 3 名患者临床上主要表现巨大血小板 和红细胞形态异常，如球形、口形红细胞和靶形细胞。红细胞渗透脆行增加。 出血时间延长、对瑞斯托霉素诱导聚集反应降低。他们血浆谷固醇、豆固醇和二氢胆固醇浓度明显增高而总胆固醇浓度正常。发现在 ABCG5 基因外显子 1 中 18802 位碱基发生 CT 突变，导致 22 位的谷氨酰胺（Q）变为终止密码子。3 名患者均为纯合子，其父母及两个亲属为杂合子对 ABCG8 基因测序未见异常。 限制性内酶 Bfa分析 70 名正常人相应序列的 PCR 产物未发现相同的基因突变。 第 3 部分 3 名患者红细胞膜的谷固醇、豆固醇和二氢胆固醇浓度明显增高。谷 固醇与红细胞孵育后，红细胞异形明显，可见口形、球形红细胞和靶形细胞。 谷固醇组红细胞渗透脆性较对照组升高。 结论：1本研究采用改良的 HPLC 法对血浆植物固醇进行定量检测，该法具有简便快速，灵敏度高，需血样品量 小及分离效果好等优点，为植物固醇血症的诊断提供了一种切实可行的检测方 法。2血细胞是血浆植物固醇毒性作用的一个靶子；显著增高的血浆植物固醇 导致了红细胞和血小板的异常；红细胞和血小板的异常是植物固醇血症的一种 特殊的表型：伴有巨大血小板和（或）难以解释的溶血性贫血的患者需与植物 固醇血症鉴别。3ABCG5 基因外显子 1 上的一个新的无义突变构成了伴有红细 胞和血小板异常的植物固醇血症的分子基础。此突变是国际尚未报道的一个新 的突变。4植物固醇血症患者不仅血浆植物固醇含量增加，而且红细胞膜上的 植物固醇含量也增加；血浆植物固醇含量的增加对红细胞形态和渗透脆性有明 显的影响。 巨大血小板病（giant platelet disorders，GPD）是一组异质性疾病，表现为 血小板减少，巨大血小板和不同程度的出血。近年来，随着实验室检测技术的 进展，新的巨大血小板病不断地被发现，但至今还有相当多的病例不能被分类 和鉴定，易造成误诊。在临床实际工作中，我们发现一些巨大血小板病不是血 小板本身的病变，而是其它疾病的一种特殊表型。最近我们遇到了一种罕见的 病例，患者除表现巨大血小板减少外，还表现为红细胞异形、溶血性贫血和血 浆植物固醇明显增高。对这种伴有巨大血小板的特殊病例进行深入细致的研究， 有助于临床医生正确的认识此类疾病，及时地作出诊断、鉴别诊断和治疗，并 为将来的进一步研究提供理论基础。 目的：巨大血小板减少与溶血性贫血共 存在血液病中十分罕见，而且人们对其认识