内科学内科学( (血液病血液病) )专业毕业论文专业毕业论文 精品论文精品论文 IgHVIgHV 框架区框架区 DNADNA 疫苗疫苗体外转染树突细胞诱导抗体外转染树突细胞诱导抗 B B 淋巴瘤的细胞毒淋巴瘤的细胞毒 T T 细胞细胞关键词：关键词：B B 细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 免疫球蛋白免疫球蛋白 DNADNA 疫苗疫苗 树突细胞树突细胞 细胞毒细胞毒 T T 淋巴细胞淋巴细胞摘要：目的： 应用免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因与细胞因 子编码序列融合的 DNA 疫苗，体外转染树突细胞，刺激培养外周血淋巴细胞， 以确定框架区 DNA 疫苗能否诱发抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞的产生，为该疫 苗下一步应用于主动免疫或过继性 T 细胞治疗的临床试验提供实验依据。 方法: 鉴定已经构建的人免疫球蛋白重链基因可变区(IgHV)的框架区基因 (FR)与粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列融合的家族性 DNA 疫苗，无内毒 素试剂盒方法提取质粒。采集人外周血单个核细胞(PBMC)，采用贴壁培养分离， 细胞因子 GM-CSF、IL-4 诱导，细胞因子“鸡尾酒”促成熟的方法培养树突细胞 (DC)，用流式细胞仪检测 DC 的表型；基因枪方法将疫苗 DNA 质粒转染 DC，反 转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确认转染质粒的表 达。同时将悬浮的 PBMC 在 IL-2 等细胞因子诱导下培养，用转染后的 DC 刺激培 养以诱导抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)的产生。用流式细胞仪检测培养的 淋巴细胞表型，采用合成的 MHC 五聚体(MHCPentamer)方法检测抗原特异性细胞 毒 T 淋巴细胞，用荧光标记的流式细胞术方法(FATAL)分析培养的 T 淋巴细胞对 B 细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用，并采用基因测序仪方法对所培养的淋巴细胞进 行 T 细胞受体 链可变区(TCRBV)基因扫描分析，观察培养前后 T 细胞各个克 隆的变化情况。 结果: 制备供转染用的无内毒素质粒 IgHV1-GM- CSF/pcDNA3.0，经酶切、PCR 鉴定，测序结果显示包含 IgHV1 前导肽、FR 区以 及连接的 GM-CSF cDNA 序列，FR 区序列包含受 HLA-A*0201 限制性的抗原九肽 QLVQSGAEV 的编码序列。 外周血 PBMC 经细胞因子诱导可以产生形态典型的 DC，显微镜下计数典型形态的 DC 占 85.096.5，获得 DC 数量占 PBMC 的 6.911.3；细胞因子促成熟后，DC 表面 CD80、C083、CD86 等标志明显增 高，显示获得成熟的 DC。比较 4 种方法转染 DC 的效率，由高到低依次为 Nucleofector 电转染、基因枪、Lipofectamine2000 和 FuGENE6，但电转染后 细胞死亡多，且失去多突触结构而变成圆形，因此选择基因枪方法转染 DC，并 对基因枪转染 DC 条件进行了优化。经 RT-PCR 及 ELISA 方法检测转染后的 DC 的 GM-CSF 水平增高，证明转染的质粒 DNA 能够在 DC 中表达。 对 2 例正常人 及 2 例 B 细胞淋巴瘤患者的 PBMC 进行细胞培养及转染或抗原肽刺激，FCM 分析 显示体外培养的淋巴细胞主要以 CD8+T 淋巴细胞增生为主；Pentamer 检测结果 显示转染 IgHV1-GM-CSF 融合疫苗的 DC 能够诱导抗原特异性 CTL 产生，最高可 达 4.36；相应的抗原 9 肽也可以诱导 CTL 的产生，但时相要早于前者。杀伤 试验显示转染 DNA 疫苗 DC 刺激的 T 细胞对具有同样 IgHV1 家族特征的 B 细胞淋 巴瘤细胞具有增强的杀伤作用，2 次刺激后的患者的 T 细胞对肿瘤细胞杀伤率 为 32.44.9，而抗原 9 肽诱导的杀伤率为 18.13.5。TCRBV 基因扫描显 示淋巴瘤、白血病患者治疗后 T 细胞各个 TCR 家族中一些淋巴细胞消失，呈 寡克隆分布或完全缺失，仅少数保持多克隆分布，而经过 DC 及细胞因子的刺激 培养后，TCR 则呈现完整的多克隆分布；经过 DNA 疫苗刺激的则呈现部分家 族个别优势克隆特征，提示抗原诱导的 CTL 克隆可能存在于其中。 结论: 1采用基因枪方法成功转染由人 PBMC 诱导培养的原代 DC，制备家族性 IgHV 框架区 DNA 疫苗免疫的 DC。 2家族性 IgHV 框架区 DNA 疫苗体外能够诱导 抗原特异性 CTL 细胞，对同 IgH 家族的 B 细胞淋巴瘤细胞具有杀伤作用。正文内容正文内容目的： 应用免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因与细胞因子 编码序列融合的 DNA 疫苗，体外转染树突细胞，刺激培养外周血淋巴细胞，以 确定框架区 DNA 疫苗能否诱发抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞的产生，为该疫苗 下一步应用于主动免疫或过继性 T 细胞治疗的临床试验提供实验依据。 方 法: 鉴定已经构建的人免疫球蛋白重链基因可变区(IgHV)的框架区基因(FR) 与粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列融合的家族性 DNA 疫苗，无内毒素试 剂盒方法提取质粒。采集人外周血单个核细胞(PBMC)，采用贴壁培养分离，细 胞因子 GM-CSF、IL-4 诱导，细胞因子“鸡尾酒”促成熟的方法培养树突细胞 (DC)，用流式细胞仪检测 DC 的表型；基因枪方法将疫苗 DNA 质粒转染 DC，反 转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确认转染质粒的表 达。同时将悬浮的 PBMC 在 IL-2 等细胞因子诱导下培养，用转染后的 DC 刺激培 养以诱导抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)的产生。用流式细胞仪检测培养的 淋巴细胞表型，采用合成的 MHC 五聚体(MHCPentamer)方法检测抗原特异性细胞 毒 T 淋巴细胞，用荧光标记的流式细胞术方法(FATAL)分析培养的 T 淋巴细胞对 B 细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用，并采用基因测序仪方法对所培养的淋巴细胞进 行 T 细胞受体 链可变区(TCRBV)基因扫描分析，观察培养前后 T 细胞各个克 隆的变化情况。 结果: 制备供转染用的无内毒素质粒 IgHV1-GM- CSF/pcDNA3.0，经酶切、PCR 鉴定，测序结果显示包含 IgHV1 前导肽、FR 区以 及连接的 GM-CSF cDNA 序列，FR 区序列包含受 HLA-A*0201 限制性的抗原九肽 QLVQSGAEV 的编码序列。 外周血 PBMC 经细胞因子诱导可以产生形态典型的 DC，显微镜下计数典型形态的 DC 占 85.096.5，获得 DC 数量占 PBMC 的 6.911.3；细胞因子促成熟后，DC 表面 CD80、C083、CD86 等标志明显增 高，显示获得成熟的 DC。比较 4 种方法转染 DC 的效率，由高到低依次为 Nucleofector 电转染、基因枪、Lipofectamine2000 和 FuGENE6，但电转染后 细胞死亡多，且失去多突触结构而变成圆形，因此选择基因枪方法转染 DC，并 对基因枪转染 DC 条件进行了优化。经 RT-PCR 及 ELISA 方法检测转染后的 DC 的 GM-CSF 水平增高，证明转染的质粒 DNA 能够在 DC 中表达。 对 2 例正常人 及 2 例 B 细胞淋巴瘤患者的 PBMC 进行细胞培养及转染或抗原肽刺激，FCM 分析 显示体外培养的淋巴细胞主要以 CD8+T 淋巴细胞增生为主；Pentamer 检测结果 显示转染 IgHV1-GM-CSF 融合疫苗的 DC 能够诱导抗原特异性 CTL 产生，最高可 达 4.36；相应的抗原 9 肽也可以诱导 CTL 的产生，但时相要早于前者。杀伤 试验显示转染 DNA 疫苗 DC 刺激的 T 细胞对具有同样 IgHV1 家族特征的 B 细胞淋 巴瘤细胞具有增强的杀伤作用，2 次刺激后的患者的 T 细胞对肿瘤细胞杀伤率 为 32.44.9，而抗原 9 肽诱导的杀伤率为 18.13.5。TCRBV 基因扫描显 示淋巴瘤、白血病患者治疗后 T 细胞各个 TCR 家族中一些淋巴细胞消失，呈 寡克隆分布或完全缺失，仅少数保持多克隆分布，而经过 DC 及细胞因子的刺激 培养后，TCR 则呈现完整的多克隆分布；经过 DNA 疫苗刺激的则呈现部分家 族个别优势克隆特征，提示抗原诱导的 CTL 克隆可能存在于其中。 结论: 1采用基因枪方法成功转染由人 PBMC 诱导培养的原代 DC，制备家族性 IgHV 框架区 DNA 疫苗免疫的 DC。 2家族性 IgHV 框架区 DNA 疫苗体外能够诱导 抗原特异性 CTL 细胞，对同 IgH 家族的 B 细胞淋巴瘤细胞具有杀伤作用。 目的： 应用免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因与细胞因子编码序列融合的 DNA 疫苗，体外转染树突细胞，刺激培养外周血淋巴细胞，以确定 框架区 DNA 疫苗能否诱发抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞的产生，为该疫苗下一 步应用于主动免疫或过继性 T 细胞治疗的临床试验提供实验依据。 方法: 鉴定已经构建的人免疫球蛋白重链基因可变区(IgHV)的框架区基因(FR)与粒-巨 噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列融合的家族性 DNA 疫苗，无内毒素试剂盒方 法提取质粒。采集人外周血单个核细胞(PBMC)，采用贴壁培养分离，细胞因子 GM-CSF、IL-4 诱导，细胞因子“鸡尾酒”促成熟的方法培养树突细胞(DC)，用 流式细胞仪检测 DC 的表型；基因枪方法将疫苗 DNA 质粒转染 DC，反转录聚合 酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确认转染质粒的表达。同时 将悬浮的 PBMC 在 IL-2 等细胞因子诱导下培养，用转染后的 DC 刺激培养以诱导 抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)的产生。用流式细胞仪检测培养的淋巴细胞 表型，采用合成的 MHC 五聚体(MHCPentamer)方法检测抗原特异性细胞毒 T 淋巴 细胞，用荧光标记的流式细胞术方法(FATAL)分析培养的 T 淋巴细胞对 B 细胞淋 巴瘤细胞的杀伤作用，并采用基因测序仪方法对所培养的淋巴细胞进行 T 细胞 受体 链可变区(TCRBV)基因扫描分析，观察培养前后 T 细胞各个克隆的变化 情况。 结果: 制备供转染用的无内毒素质粒 IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0， 经酶切、PCR 鉴定，测序结果显示包含 IgHV1 前导肽、FR 区以及连接的 GM-CSF cDNA 序列，FR 区序列包含受 HLA-A*0201 限制性的抗原九肽 QLVQSGAEV 的编码 序列。 外周血 PBMC 经细胞因子诱导可以产生形态典型的 DC，显微镜下计数 典型形态的 DC 占 85.096.5，获得 DC 数量占 PBMC 的 6.911.3；细 胞因子促成熟后，DC 表面 CD80、C083、CD86 等标志明显增高，显示获得成熟 的 DC。比较 4 种方法转染 DC 的效率，由高到低依次为 Nucleofector 电转染、 基因枪、Lipofectamine2000 和 FuGENE6，但电转染后细胞死亡多，且失去多突 触结构而变成圆形，因此选择基因枪方法转染 DC，并对基因枪转染 DC 条件进 行了优化。经 RT-PCR 及 ELISA 方法检测转染后的 DC 的 GM-CSF 水平增高，证明 转染的质粒 DNA 能够在 DC 中表达。 对 2 例正常人及 2 例 B 细胞淋巴瘤患者 的 PBMC 进行细胞培养及转染或抗原肽刺激，FCM 分析显示体外培养的淋巴细胞