外科学外科学( (泌尿外泌尿外) )专业优秀论文专业优秀论文 HCMVHCMV UL82UL82 基因重组质粒在基因重组质粒在 HFFHFF 中中的表达及其的表达及其 MabMab 的制备的制备关键词：人巨细胞病毒关键词：人巨细胞病毒 蛋白纯化蛋白纯化 人包皮成纤维细胞人包皮成纤维细胞 单克隆抗体单克隆抗体 杂交瘤杂交瘤 基因基因 表达表达摘要：人巨细胞病毒含有约 20-25 种蛋白质，其中在介导 HCMV 感染和病毒复制 中有 3 种蛋白作用最为重要，即由 ORFUL82 编码的磷蛋白 pp71、ORFUL83 编码 的 pp65 和 ORFUL69 编码的 PUL69。上述 3 种蛋白共同的特点是启动 HCMV 对宿 主细胞的感染和病毒的复制，同时在逃逸 T 淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也 具有重要作用。新近的研究表明，在这 3 种间层蛋白中以 ORFUL82 编码的蛋白 pp7 的作用最为显著，该 pp71 蛋白单独存在时，是一种较强的抗原蛋白，可刺 激机体产生抗体，有助于清除病毒；在器官移植者，HCMV 感染后 pp71 蛋白的 产生可以明显增强细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，从而引起移植物血管病变 和排斥反应1。在视网膜母细胞瘤，pp71 蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白 P105、P107、P130 等的衰变2，3。pp71 蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周 期并使它们停止在 G1 晚期，而这段时期对病毒复制最为有利，所以它能够增加 病毒繁殖，加快病毒在细胞间传递，体外将 HCMV 转染人纤维细胞后，病毒 DNA 复制效率在共转染 ORFUL82 条件下，感染及复制效率增加了 80 倍4-9。研究 证实 pp71 不仅对 HCMV 的 IE1 和 IE2 基因表达有促进作用，而且对晚期基因的 表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用10。因此，Baldick 指出，ORFUL82(pp71 蛋白)可作为抗 HCMV 病毒药物设计的有效靶点11，12。 为进一步研究 pp71 蛋白基因在真核细胞-人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达，并 制备抗 pp71 单克隆抗体，为临床研制新型抗 HCMV 药奠定坚实基础，本研究进 行了以下工作： 1.人包皮成纤维细胞的培养 取已冻存的第 3 代 HFF 细胞， 在含 10小牛血清(FBS)的 DMEM 完全培养基中培养，待细胞生长接近铺满培养 瓶壁时，按 1：3 分瓶培养，并标记传代时间，代数及细胞名称，于 37、 5CO2 孵箱中继续培养。将传至对数生长期的第 14 代 HFF 细胞封管冻存，以 备后用。 2.基因重组质粒 pSG5-pp71 的鉴定 (1)利用氯化钙法将重组质粒 pSG5-pp71 转入 DH5 大肠杆菌内。 (2)提取重组质粒 pSG5-pp71，以 BamHI、EcoRI 单酶和双酶切方法初步鉴定阳性克隆基因；设计引物，用 PCR 方 法扩增目的基因片段进一步鉴定重组质粒，然后测序。对 pp71 基因 DNA 片段的 测序结果，与基因库中的标准序列比较，同源性为 100，说明重组质粒已成 功构建。 3.基因重组质粒 pSG5-pp71 在 HFF 细胞中的表达与纯化鉴定 (1) 基因重组质粒 pSG5-pp71 在人包皮纤维细胞中稳定转染。 (2)以抽提的 HFF 细胞总 RNA 为模板，合成的两对引物为扩增对象，行 RT-PCR 检测重组质粒表达 是否成功。 (3)表达产物的 Western blot 鉴定稳定转染 pSG5-pp71 的人包皮 成纤维细胞裂解物依次经 Ni-NTA 亲和层析纯化及 SDS-PAGE 蛋白电泳后， Western blot 检测发现在 Mr 为 71000 左右处有一条针对 pp71 抗体的特异性条 带，与理论分子量一致。 4.将纯化后的 pp71 蛋白作为抗原免疫 Balb/c 小鼠， 采用杂交瘤技术，制备抗 pp71 的单克隆抗体(Mab)，得到 3 株均为 IgG1 Kappa 型 Mab(2D10，1C3 和 1A6)。将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的 Balb/c 小鼠腹腔中制备腹水型抗人的 pp71 Mab。酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达为 1：1051：106；Mab 亲和力实验结果表明，三株单克隆抗体的亲 和力依次为 2D10gt;1A6gt;1C3；Western blot 结果鉴定提示该 Mab 可以特异性的结合 pp71，其分子量约为 71103kD。 综上所述，我们应用细 胞培养技术及基因工程技术及方法，获得了具有特异性抗原性的 pp71 蛋白，制 备了其单克隆抗体。这为我们进一步探讨 HCMV UL82 基因在免疫自稳调节中的 地位、精确的识别抑制性受体在细胞内的靶点及其它生物学功能奠定了坚实的 基础；同时，为下一步获取大规模抗 pp71 单克隆抗体，为临床研制新型抗 HCMV 药物开拓了思路。正文内容正文内容人巨细胞病毒含有约 20-25 种蛋白质，其中在介导 HCMV 感染和病毒复制中 有 3 种蛋白作用最为重要，即由 ORFUL82 编码的磷蛋白 pp71、ORFUL83 编码的 pp65 和 ORFUL69 编码的 PUL69。上述 3 种蛋白共同的特点是启动 HCMV 对宿主细 胞的感染和病毒的复制，同时在逃逸 T 淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有 重要作用。新近的研究表明，在这 3 种间层蛋白中以 ORFUL82 编码的蛋白 pp7 的作用最为显著，该 pp71 蛋白单独存在时，是一种较强的抗原蛋白，可刺激机 体产生抗体，有助于清除病毒；在器官移植者，HCMV 感染后 pp71 蛋白的产生 可以明显增强细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，从而引起移植物血管病变和排 斥反应1。在视网膜母细胞瘤，pp71 蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白 P105、P107、P130 等的衰变2，3。pp71 蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周 期并使它们停止在 G1 晚期，而这段时期对病毒复制最为有利，所以它能够增加 病毒繁殖，加快病毒在细胞间传递，体外将 HCMV 转染人纤维细胞后，病毒 DNA 复制效率在共转染 ORFUL82 条件下，感染及复制效率增加了 80 倍4-9。研究 证实 pp71 不仅对 HCMV 的 IE1 和 IE2 基因表达有促进作用，而且对晚期基因的 表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用10。因此，Baldick 指出，ORFUL82(pp71 蛋白)可作为抗 HCMV 病毒药物设计的有效靶点11，12。 为进一步研究 pp71 蛋白基因在真核细胞-人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达，并 制备抗 pp71 单克隆抗体，为临床研制新型抗 HCMV 药奠定坚实基础，本研究进 行了以下工作： 1.人包皮成纤维细胞的培养 取已冻存的第 3 代 HFF 细胞， 在含 10小牛血清(FBS)的 DMEM 完全培养基中培养，待细胞生长接近铺满培养 瓶壁时，按 1：3 分瓶培养，并标记传代时间，代数及细胞名称，于 37、 5CO2 孵箱中继续培养。将传至对数生长期的第 14 代 HFF 细胞封管冻存，以 备后用。 2.基因重组质粒 pSG5-pp71 的鉴定 (1)利用氯化钙法将重组质粒 pSG5-pp71 转入 DH5 大肠杆菌内。 (2)提取重组质粒 pSG5-pp71，以 BamHI、EcoRI 单酶和双酶切方法初步鉴定阳性克隆基因；设计引物，用 PCR 方 法扩增目的基因片段进一步鉴定重组质粒，然后测序。对 pp71 基因 DNA 片段的 测序结果，与基因库中的标准序列比较，同源性为 100，说明重组质粒已成 功构建。 3.基因重组质粒 pSG5-pp71 在 HFF 细胞中的表达与纯化鉴定 (1) 基因重组质粒 pSG5-pp71 在人包皮纤维细胞中稳定转染。 (2)以抽提的 HFF 细胞总 RNA 为模板，合成的两对引物为扩增对象，行 RT-PCR 检测重组质粒表达 是否成功。 (3)表达产物的 Western blot 鉴定稳定转染 pSG5-pp71 的人包皮 成纤维细胞裂解物依次经 Ni-NTA 亲和层析纯化及 SDS-PAGE 蛋白电泳后， Western blot 检测发现在 Mr 为 71000 左右处有一条针对 pp71 抗体的特异性条 带，与理论分子量一致。 4.将纯化后的 pp71 蛋白作为抗原免疫 Balb/c 小鼠， 采用杂交瘤技术，制备抗 pp71 的单克隆抗体(Mab)，得到 3 株均为 IgG1 Kappa 型 Mab(2D10，1C3 和 1A6)。将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的 Balb/c 小鼠腹腔中制备腹水型抗人的 pp71 Mab。酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水 效价可达为 1：1051：106；Mab 亲和力实验结果表明，三株单克隆抗体的亲 和力依次为 2D10gt;1A6gt;1C3；Western blot 结果鉴定提示该 Mab 可以特异性的结合 pp71，其分子量约为 71103kD。 综上所述，我们应用细 胞培养技术及基因工程技术及方法，获得了具有特异性抗原性的 pp71 蛋白，制 备了其单克隆抗体。这为我们进一步探讨 HCMV UL82 基因在免疫自稳调节中的地位、精确的识别抑制性受体在细胞内的靶点及其它生物学功能奠定了坚实的 基础；同时，为下一步获取大规模抗 pp71 单克隆抗体，为临床研制新型抗 HCMV 药物开拓了思路。 人巨细胞病毒含有约 20-25 种蛋白质，其中在介导 HCMV 感染和病毒复制中有 3 种蛋白作用最为重要，即由 ORFUL82 编码的磷蛋白 pp71、ORFUL83 编码的 pp65 和 ORFUL69 编码的 PUL69。上述 3 种蛋白共同的特点是启动 HCMV 对宿主细胞的 感染和病毒的复制，同时在逃逸 T 淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要 作用。新近的研究表明，在这 3 种间层蛋白中以 ORFUL82 编码的蛋白 pp7 的作 用最为显著，该 pp71 蛋白单独存在时，是一种较强的抗原蛋白，可刺激机体产 生抗体，有助于清除病毒；在器官移植者，HCMV 感染后 pp71 蛋白的产生可以 明显增强细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，从而引起移植物血管病变和排斥反 应1。在视网膜母细胞瘤，pp71 蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白 P105、P107、P130 等的衰变2，3。pp71 蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周 期并使它们停止在 G1 晚期，而这段时期对病毒复制最为有利，所以它能够增加 病毒繁殖，加快病毒在细胞间传递，体外将 HCMV 转染人纤维细胞后，病毒 DNA 复制效率在共转染 ORFUL82 条件下，感染及复制效率增加了 80 倍4-9。研究 证实 pp71 不仅对 HCMV 的 IE1 和 IE2 基因表达有促进作用，而且对晚期基因的 表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用10。因此，Baldick 指出，ORFUL82(pp71 蛋白)可作为抗 HCMV 病毒药物设计的有效靶点11，12。 为进一步研究 pp71 蛋白基因在真核细胞-人包皮成纤维细胞(HFF)中的表达，并 制备抗 pp71 单克隆抗体，为临床研制新型抗 HCMV 药奠定坚实基础，本研究进 行了以下工作： 1.人包皮成纤维细胞的培养 取已冻存的第 3 代 HFF 细胞， 在含 10小牛血清(FBS)的 DMEM 完全培养基中培养，待细胞生长接近铺满培养 瓶壁时，按 1：3 分瓶培养，并标记传代时间，代数及细胞名称，于 37、 5CO2 孵箱中继续培养。将传至对数生长期的第 14 代 HFF 细胞封管冻存，