康复医学与理疗学康复医学与理疗学( (激光医学激光医学) )专业毕业论文专业毕业论文 精品论文精品论文 血卟啉血卟啉单甲醚光动力学疗法抑制增生性瘢痕的实验研究单甲醚光动力学疗法抑制增生性瘢痕的实验研究关键词：光动力学疗法关键词：光动力学疗法 血卟啉单甲醚血卟啉单甲醚 增生性瘢痕增生性瘢痕 细胞凋亡细胞凋亡 信号转导信号转导摘要：目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积 的纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为 光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步 探讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收 特性及 HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式 细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸 收 HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测 HSF 中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3- FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、 光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内 TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱 导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT 后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后 HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD- FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内 Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM 检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测 细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后， 将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg， 分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光， 治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕 厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形 态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观 察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育 浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵 育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓 度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使 IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制 S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF- 1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高， HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量 增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内 Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白 减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波 纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高，并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制 剂组 HSF 的细胞浆中 Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组 active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低； PI 染色分析表明对照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的 凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢 痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密 度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳 瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MVD 显 著减少；在透射电镜下观察到对照组中有大量 HSF，胞浆内粗面内质网丰富， 高尔基体发达，线粒体增加，PDT 组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少，核蛋 白体有不同程度的脱颗粒和解聚，胞质中见较多游离核糖体，线粒体肿胀，嵴 溶解。 结论： 1HSF 对 HMME 的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增 加，HMME-PDT 处理 HSF 时，光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率 的重要因素，PDT 改变各期细胞的分布比例，抑制细胞增殖。 2HMME-PDT 能够阻止 TGF-1 的信号经由 Smad 蛋白传向细胞核，改变 TGF-1、磷酸化 Smad3 和 Smad7 在 HSF 细胞水平的表达，使细胞增殖及胶原合成有关的靶基因 得不到激活，从而抑制 HSF 增殖和胶原合成。 3HMME-PDT 诱导 HSF 发生的 凋亡效应与 Caspase-3 的激活密切相关，但该凋亡效应并不依赖于 Caspase- 3，可能与 AIF 等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4HMME-PDT 对 兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果，与光敏剂的剂量 和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成 早期，HMME-PDT 能够抑制兔耳 HSF 的增殖，破坏蛋白合成场所，并能诱导部分 细胞进入凋亡途径，HMME-PDT 有可能成为瘢痕防治的有效方法。正文内容正文内容目的： 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的 纤维化疾病，是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光 敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探 讨其作用机制，在动物瘢痕模型上观察 HMME-PDT 的生物学效应，为临床应用 HMME-PDT 防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法： 1HSF 对 HMME 的吸收 特性及 HMME-PDT 对其增殖效应的研究：取原代培养的第 46 代 HSF，经流式 细胞仪(FCM)检测孵育浓度(040g/ml)和孵育时间(0120min)对 HSF 细胞吸 收 HMME 的影响；MTT 法检测 HMME-PDT 对 HSF 细胞存活率的影响；银染法检测 HSF 中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况；FCM 分析细胞周期的变化。2HMME-PDT 对 HSF 中 TGF-1/Smad 信号通路的影响：用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测 HMME-PDT 后 HSF 分泌至上清液的 TGF-1 蛋白表达量；用 Smad3- FITC 标记后在荧光显微镜上观察细胞内 Smad3 的荧光强度；将细胞分为对照组、 光敏剂组、照光组和 HMME-PDT 组，经 Western-blot 方法检测各组细胞浆内 TGF-1、磷酸化和非磷酸化 Smad3、Smad7 蛋白的表达量。 3HMME-PDT 诱 导 HSF 凋亡效应的研究：Hoechst33258 染色后在荧光显微镜上观察 HMME-PDT 后 HSF 细胞形态学变化；Annexin V-FITC-PI 双染后经 FCM 检测 HMME-PDT 后 HSF 细胞凋亡率和坏死率；将 HSF 爬片后分为对照组、HMME-PDT 组和 Z-DEVD- FMK 抑制剂组，Caspase3-FITC-PI 染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内 Caspase3 的荧光强度；收集各组细胞在 active-Caspase3-FITC 单染后经 FCM 检测 active-Caspase3 阳性细胞百分率；收集各组细胞在 PI 单染后经 FCM 检测 细胞凋亡率。 4HMME-PDT 对兔耳瘢痕的效应研究：建立兔耳瘢痕模型后， 将瘢痕块分为不同组别，照光功率密度为 20mW/cm2，光敏剂剂量为 10mg/kg， 分别在给药后即刻、0.5、1、3h 给予 2.5、5、10、20J/cm2 的能量密度照光， 治疗后第 10 天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI)；HE 染色后观察瘢痕 厚度、细胞及胶原分布等形态学变化；观察 HMME-PDT 后瘢痕中微血管数量、形 态变化，采用 Weidner 计数方法，计算平均微血管密度(MVD)；运用透射电镜观 察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果： 1在一定孵育 浓度范围内(040g/ml)，HSF 细胞对 HMME 的吸收量随孵育浓度的增高和孵 育时间的增加而增大。实验范围内的 HMME-PDT 对 HSF 细胞的杀伤效应与孵育浓 度和激光能量密度正相关；HMME-PDT 能够减少 HSF 细胞中 AgNORs 的含量，使 IS值降低；HMME-PDT 降低 HSF 增殖指数，改变各期细胞的分布比例，抑制 S 期 DNA 合成，使细胞滞留在 G0/G1 期。 2HSF 分泌至细胞上清液的 TGF- 1 蛋白含量较高，而 HMME-PDT 后降低；HSF 合成的 TGF-1 蛋白水平高， HMME-PDT 后 HSF 中的 TGF-1 和磷酸化 Smad3 蛋白含量减少，Smad7 蛋白含量 增加，光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变；PDT 不能改变 HSF 内 Smad3 蛋白表达量，但其在细胞内的分布发生变化，进入细胞核的 Smad3 蛋白 减少。 3HMME-PDT 治疗后细胞核染色质高度凝聚，呈团块颗粒状，或呈波 纹状、折缝样改变；Annexin V-FITC-PI 双染结果表明 PDT 后凋亡率显著升高， 并伴有细胞坏死的发生，但组内坏死率低于凋亡率；对照组和 Z-DEVD-FMK 抑制 剂组 HSF 的细胞浆中 Caspase3-FITC 荧光微弱，PDT 组荧光显著增强；对照组 active-Caspase-3 阳性细胞百分率低，HMME-PDT 组上升，Z-DEVD-FMK 组降低； PI 染色分析表明对照组凋亡率低，PDT 组的凋亡率显著升高，Z-DEVD-FMK 组的凋亡率低于 PDT 组，但仍然显著高于对照组。 4在本研究的兔耳增生性瘢 痕块中，静脉注射 HMME10mg/kg 后 30min，给予功率密度为 20mW/cm2，能量密 度为 5J/cm2 的 630nm 红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应；对照组兔耳 瘢痕块真皮层显著增厚，血管分布丰富，HMME-PDT 组瘢痕块厚度下降，MV