预防兽医学专业毕业论文预防兽医学专业毕业论文 精品论文精品论文 猪伪狂犬病毒猪伪狂犬病毒 gDgD 和和 gEgE 基基因的原核表达及单克隆抗体的研制因的原核表达及单克隆抗体的研制关键词：猪伪狂犬病关键词：猪伪狂犬病 伪狂犬病病毒伪狂犬病病毒 原核表达原核表达 单克隆抗体单克隆抗体 诊断检测诊断检测摘要：猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。我国自 1947 年首次报道该 病以来，随着养猪业集约化规模化的发展，已有 20 多个省市报道发生了该病， 并在许多种猪场呈暴发流行趋势，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此， 建立有效的诊断检测方法对控制和消灭 PR 具有重要的意义。 本研究分离鉴 定猪伪狂犬病病毒(JS 株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律；利用大肠杆菌 表达系统表达了 PRV gD 和 gE 蛋白；研制出针对 PRV 的单克隆抗体。 1、猪 PRV JS 株的分离鉴定及感染猪体内病毒核酸的分布规律 用 PRV 特异性的引 物对江苏某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行 PCR 鉴定，可扩增到 特异性的条带。以病料接种 PK-15 细胞，24 小时即出现细胞病变，PCR 法和病 毒分离试验均证明所分离病毒为 PRV。PRV 分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹 致死，接种仔猪后出现持续发热，肌肉震颤等症状，因此该分离株为强毒株， 命名为 JSZ。对自然感染发病猪脏器进行 PCR 检测，病毒在仔猪体内广泛分布， 其中脾脏的检出率最高，可达 100；对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进 行 PCR 检测，病猪排毒最长可达 13 天。PRV JSZ 的分离鉴定为病原学研究提供 了生物材料，病毒核酸排毒规律研究为病毒抗原的检测提供依据。 2、PRV gD、gE 基因的克隆及原核表达 参照 Genbank 发表的 PRV gD 和 gE 基因序列， 分别设计两对引物，通过 PCR 方法扩增出 PRV 糖蛋白 gD 的 668 bp 基因片段和 PRV 糖蛋白 gE 基因去信号肽后的主要抗原区域 558 bp 基因片段，克隆至 pET- 32a 的 T7 启动子的下游，分别命名为 pET-32a-D 和 pET-32a-E，在 IPTG 诱导后， SDS-PAGE 电泳发现，pET-32a-D 和 pET-32a-E 均在大肠杆菌中得到了高效表达， 重组蛋白条带大小分别为 45 kDa 和 43 kDa。PRV gD、gE 蛋白的表达为建立 PRV 抗体检测方法提供了基础材料。 3、PRV 单克隆抗体的制备 以 PK-15 细胞增殖 PRV，将收获的病毒用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化，将纯化后 的抗原免疫 BALB/C 小鼠，取免疫鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合。用间接 ELISA 方法筛选阳性克隆，并采用有限稀释法对其进行亚克隆，共获得 6 株能 稳定分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 2F5、2G10、3H10、4D11、684、6D5。单抗 2F5 亚类为 IgG，其余均属于 IgM。 所有单抗具有良好的特异性，与 PPV、PRRSV、PCV2、HCV 无交叉反应。这些单 抗的成功研制为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速诊断 PRV 抗原的方 法打下了基础。正文内容正文内容猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。我国自 1947 年首次报道该 病以来，随着养猪业集约化规模化的发展，已有 20 多个省市报道发生了该病， 并在许多种猪场呈暴发流行趋势，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此， 建立有效的诊断检测方法对控制和消灭 PR 具有重要的意义。 本研究分离鉴 定猪伪狂犬病病毒(JS 株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律；利用大肠杆菌 表达系统表达了 PRV gD 和 gE 蛋白；研制出针对 PRV 的单克隆抗体。 1、猪 PRV JS 株的分离鉴定及感染猪体内病毒核酸的分布规律 用 PRV 特异性的引 物对江苏某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行 PCR 鉴定，可扩增到 特异性的条带。以病料接种 PK-15 细胞，24 小时即出现细胞病变，PCR 法和病 毒分离试验均证明所分离病毒为 PRV。PRV 分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹 致死，接种仔猪后出现持续发热，肌肉震颤等症状，因此该分离株为强毒株， 命名为 JSZ。对自然感染发病猪脏器进行 PCR 检测，病毒在仔猪体内广泛分布， 其中脾脏的检出率最高，可达 100；对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进 行 PCR 检测，病猪排毒最长可达 13 天。PRV JSZ 的分离鉴定为病原学研究提供 了生物材料，病毒核酸排毒规律研究为病毒抗原的检测提供依据。 2、PRV gD、gE 基因的克隆及原核表达 参照 Genbank 发表的 PRV gD 和 gE 基因序列， 分别设计两对引物，通过 PCR 方法扩增出 PRV 糖蛋白 gD 的 668 bp 基因片段和 PRV 糖蛋白 gE 基因去信号肽后的主要抗原区域 558 bp 基因片段，克隆至 pET- 32a 的 T7 启动子的下游，分别命名为 pET-32a-D 和 pET-32a-E，在 IPTG 诱导后， SDS-PAGE 电泳发现，pET-32a-D 和 pET-32a-E 均在大肠杆菌中得到了高效表达， 重组蛋白条带大小分别为 45 kDa 和 43 kDa。PRV gD、gE 蛋白的表达为建立 PRV 抗体检测方法提供了基础材料。 3、PRV 单克隆抗体的制备 以 PK-15 细胞增殖 PRV，将收获的病毒用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化，将纯化后 的抗原免疫 BALB/C 小鼠，取免疫鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合。用间接 ELISA 方法筛选阳性克隆，并采用有限稀释法对其进行亚克隆，共获得 6 株能 稳定分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 2F5、2G10、3H10、4D11、684、6D5。单抗 2F5 亚类为 IgG，其余均属于 IgM。 所有单抗具有良好的特异性，与 PPV、PRRSV、PCV2、HCV 无交叉反应。这些单 抗的成功研制为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速诊断 PRV 抗原的方 法打下了基础。 猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。我国自 1947 年首次报道该 病以来，随着养猪业集约化规模化的发展，已有 20 多个省市报道发生了该病， 并在许多种猪场呈暴发流行趋势，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此， 建立有效的诊断检测方法对控制和消灭 PR 具有重要的意义。 本研究分离鉴 定猪伪狂犬病病毒(JS 株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律；利用大肠杆菌 表达系统表达了 PRV gD 和 gE 蛋白；研制出针对 PRV 的单克隆抗体。 1、猪 PRV JS 株的分离鉴定及感染猪体内病毒核酸的分布规律 用 PRV 特异性的引 物对江苏某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行 PCR 鉴定，可扩增到 特异性的条带。以病料接种 PK-15 细胞，24 小时即出现细胞病变，PCR 法和病 毒分离试验均证明所分离病毒为 PRV。PRV 分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死，接种仔猪后出现持续发热，肌肉震颤等症状，因此该分离株为强毒株， 命名为 JSZ。对自然感染发病猪脏器进行 PCR 检测，病毒在仔猪体内广泛分布， 其中脾脏的检出率最高，可达 100；对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进 行 PCR 检测，病猪排毒最长可达 13 天。PRV JSZ 的分离鉴定为病原学研究提供 了生物材料，病毒核酸排毒规律研究为病毒抗原的检测提供依据。 2、PRV gD、gE 基因的克隆及原核表达 参照 Genbank 发表的 PRV gD 和 gE 基因序列， 分别设计两对引物，通过 PCR 方法扩增出 PRV 糖蛋白 gD 的 668 bp 基因片段和 PRV 糖蛋白 gE 基因去信号肽后的主要抗原区域 558 bp 基因片段，克隆至 pET- 32a 的 T7 启动子的下游，分别命名为 pET-32a-D 和 pET-32a-E，在 IPTG 诱导后， SDS-PAGE 电泳发现，pET-32a-D 和 pET-32a-E 均在大肠杆菌中得到了高效表达， 重组蛋白条带大小分别为 45 kDa 和 43 kDa。PRV gD、gE 蛋白的表达为建立 PRV 抗体检测方法提供了基础材料。 3、PRV 单克隆抗体的制备 以 PK-15 细胞增殖 PRV，将收获的病毒用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化，将纯化后 的抗原免疫 BALB/C 小鼠，取免疫鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合。用间接 ELISA 方法筛选阳性克隆，并采用有限稀释法对其进行亚克隆，共获得 6 株能 稳定分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 2F5、2G10、3H10、4D11、684、6D5。单抗 2F5 亚类为 IgG，其余均属于 IgM。 所有单抗具有良好的特异性，与 PPV、PRRSV、PCV2、HCV 无交叉反应。这些单 抗的成功研制为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速诊断 PRV 抗原的方 法打下了基础。 猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。我国自 1947 年首次报道该 病以来，随着养猪业集约化规模化的发展，已有 20 多个省市报道发生了该病， 并在许多种猪场呈暴发流行趋势，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此， 建立有效的诊断检测方法对控制和消灭 PR 具有重要的意义。 本研究分离鉴 定猪伪狂犬病病毒(JS 株)并探索了猪体内病毒核酸的分布规律；利用大肠杆菌 表达系统表达了 PRV gD 和 gE 蛋白；研制出针对 PRV 的单克隆抗体。 1、猪 PRV JS 株的分离鉴定及感染猪体内病毒核酸的分布规律 用 PRV 特异性的引 物对江苏某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行 PCR 鉴定，可扩增到 特异性的条带。以病料接种 PK-15 细胞，24 小时即出现细胞病变，PCR 法和病 毒分离试验均证明所分离病毒为 PRV。PRV 分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹 致死，接种仔猪后出现持续发热，肌肉震颤等症状，因此该分离株为强毒株， 命名为 JSZ。对自然感染发病猪脏器进行 PCR 检测，病毒在仔猪体内广泛分布， 其中脾脏的检出率最高，可达 100；对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进 行 PCR 检测，病猪排毒最长可达 13 天。PRV JSZ 的分离鉴定为病原学研究提供 了生物材料，病毒核酸排毒规律研究为病毒抗原的检测提供依据。 2、PRV gD、gE 基因的克隆及原核表达 参照 Genbank 发表的 PRV gD 和 gE 基因序列， 分别设计两对引物，通过 PCR 方法扩增出 PRV 糖蛋白 gD 的 668 bp 基因片段和 PRV 糖蛋白 gE 基因去信号肽后的主要抗原区域 558 bp 基因片段，克隆至 pET- 32a 的 T7 启动子的下游，分别命名为 pET-32a-D 和 pET-32a-E，在 IPTG 诱导后， SDS-PAGE 电泳发现，pET-32a-D 和 pET-32a-E 均在大肠杆菌中得到了高效表达， 重组蛋白条带大小分别为 45 kDa 和 43 kDa。PRV gD、gE 蛋白的表达为建立 PRV 抗体检测方法提