微生物学专业优秀论文微生物学专业优秀论文 登革病毒特异性登革病毒特异性 T T 细胞表位的研究细胞表位的研究关键词：关键词：T T 细胞表位细胞表位 ELISPOTELISPOT 试验试验 ICS-FCICS-FC 术技术术技术 HLAHLA typingtyping 登革病毒登革病毒 特异特异 性性摘要：背景： 登革病毒(DEN)为黄病毒属的单股正链 RNA 病毒，包括 4 个血 清型。DEN 感染一般引起登革热(DF)，严重时引起登革出血热(DHF)和登革休克 综合症(DSS)。自从 1978 年广东省佛山地区和广州地区重现 DF 以来，每隔几年 广州地区都有不同程度的 DF 流行。DF 的流行(尤其是 DHF/DSS)严重危害了本地 区人们的健康和经济的发展。目前，对 DHF/DSS 的发病机理不清楚(尤其是 T 细 胞免疫反应在其中所起的作用)严重阻碍了 DEN 疫苗的研发。感染 DEN 或接受候 选 DEN 疫苗后，机体内产生了 DEN 血清型特异性 T 细胞和血清型间交叉反应性 T 细胞。研究表明，DEN 血清型特异性 T 细胞免疫反应可以保护机体免受同型病 毒的再次感染，而 DEN 血清型间交叉反应性 T 细胞免疫反应不但能清除病毒、 抑制其复制而且参与了 DHF/DSS 的发病。T 细胞表位是激发 T 细胞免疫的必备 因素，因此鉴定并研究 DEN 特异性 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 的发病机理、 研发基于登革 T 细胞表位的多肽疫苗都具有重要的作用。 目的： 筛选 DEN 特异性 T 细胞表位并进行免疫学特性的研究；分析各表位的潜在应用价值， 为 DHF/DSS 发病机理的阐明和登革 T 细胞表位多肽疫苗的研制奠定基础。 方 法： 应用 RT-PCR、5RACE(Rapid amplication of cDNA ends)和 3RACE 技术对 2002 年从广州分离的一株 DEN-1(71/GZ02 株)进行全序列测定；应用 Mega 4.0 系统进化分析软件对 71/GZ02 株同历年广东省内分离的 DEN-1 株及世 界上其他地方分离的 DEN-1 株的进化关系进行分析，从而为本课题中 T 细胞表 位预测选择地方代表株；基于 71/GZ02 株，GZ/80 株及 DEN-1、2、3、4 的一些 参考株，利用 Rankpep 在线软件预测 DEN 特异性 T 细胞表位；选择在 DEN-1 或 多种 DEN 血清型分离株中保守并且预测的其限制性的 HLA-或类分子的等位 基因型在中国南方人群中占较高比率的 T 细胞表位作为候选表位，并以此合成 多肽；分离 DF(DEN-1 感染引起)恢复者的 PBMCs(Peripheralblood mononuclear cells外周血单个核细胞)，用合成的多肽刺激 PBMCs，利用 ELISPOT(Enzeyme-linked immunospot assay，酶联免疫斑点试验)、ICS- FC(Intracellular cytokinestaining and flow cytometry，细胞内细胞因子 染色/流式细胞术)和 ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，酶联免疫吸 附试验)技术检测 IFN- 分泌细胞数目及细胞培养上清中 IFN- 的产生量，从 而确定 DEN 特异性 T 细胞表位；对 DF 恢复者进行 HLA 分型，进而确定 DEN 特异 性 T 细胞表位其限制性的 HLA 等位基因型。 结论： 1、71/GZ02 株对广州 地区 DEN-1 分离株具有较好的代表性； 2、首次在国内利用生物信息学技术 结合体外免疫学试验确定了 9 条 DEN 特异性 T 细胞表位。这 9 条 T 细胞表位包 括在单一 DEN 血清型中保守的表位和在多种 DEN 血清中保守的表位，提示这些 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 发病机理和研发基于 T 细胞表位的多肽疫苗中都 具有非常重要的价值； 3、由于这些 T 细胞表位其限制性的 HLA 等位基因型 在中国南方人群中占有较高的比率，因此，这些表位具有广泛的人群覆盖性和 潜在的广阔的应用前景。正文内容正文内容背景： 登革病毒(DEN)为黄病毒属的单股正链 RNA 病毒，包括 4 个血清 型。DEN 感染一般引起登革热(DF)，严重时引起登革出血热(DHF)和登革休克综 合症(DSS)。自从 1978 年广东省佛山地区和广州地区重现 DF 以来，每隔几年广 州地区都有不同程度的 DF 流行。DF 的流行(尤其是 DHF/DSS)严重危害了本地区 人们的健康和经济的发展。目前，对 DHF/DSS 的发病机理不清楚(尤其是 T 细胞 免疫反应在其中所起的作用)严重阻碍了 DEN 疫苗的研发。感染 DEN 或接受候选 DEN 疫苗后，机体内产生了 DEN 血清型特异性 T 细胞和血清型间交叉反应性 T 细胞。研究表明，DEN 血清型特异性 T 细胞免疫反应可以保护机体免受同型病 毒的再次感染，而 DEN 血清型间交叉反应性 T 细胞免疫反应不但能清除病毒、 抑制其复制而且参与了 DHF/DSS 的发病。T 细胞表位是激发 T 细胞免疫的必备 因素，因此鉴定并研究 DEN 特异性 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 的发病机理、 研发基于登革 T 细胞表位的多肽疫苗都具有重要的作用。 目的： 筛选 DEN 特异性 T 细胞表位并进行免疫学特性的研究；分析各表位的潜在应用价值， 为 DHF/DSS 发病机理的阐明和登革 T 细胞表位多肽疫苗的研制奠定基础。 方 法： 应用 RT-PCR、5RACE(Rapid amplication of cDNA ends)和 3RACE 技术对 2002 年从广州分离的一株 DEN-1(71/GZ02 株)进行全序列测定；应用 Mega 4.0 系统进化分析软件对 71/GZ02 株同历年广东省内分离的 DEN-1 株及世 界上其他地方分离的 DEN-1 株的进化关系进行分析，从而为本课题中 T 细胞表 位预测选择地方代表株；基于 71/GZ02 株，GZ/80 株及 DEN-1、2、3、4 的一些 参考株，利用 Rankpep 在线软件预测 DEN 特异性 T 细胞表位；选择在 DEN-1 或 多种 DEN 血清型分离株中保守并且预测的其限制性的 HLA-或类分子的等位 基因型在中国南方人群中占较高比率的 T 细胞表位作为候选表位，并以此合成 多肽；分离 DF(DEN-1 感染引起)恢复者的 PBMCs(Peripheralblood mononuclear cells外周血单个核细胞)，用合成的多肽刺激 PBMCs，利用 ELISPOT(Enzeyme-linked immunospot assay，酶联免疫斑点试验)、ICS- FC(Intracellular cytokinestaining and flow cytometry，细胞内细胞因子 染色/流式细胞术)和 ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，酶联免疫吸 附试验)技术检测 IFN- 分泌细胞数目及细胞培养上清中 IFN- 的产生量，从 而确定 DEN 特异性 T 细胞表位；对 DF 恢复者进行 HLA 分型，进而确定 DEN 特异 性 T 细胞表位其限制性的 HLA 等位基因型。 结论： 1、71/GZ02 株对广州 地区 DEN-1 分离株具有较好的代表性； 2、首次在国内利用生物信息学技术 结合体外免疫学试验确定了 9 条 DEN 特异性 T 细胞表位。这 9 条 T 细胞表位包 括在单一 DEN 血清型中保守的表位和在多种 DEN 血清中保守的表位，提示这些 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 发病机理和研发基于 T 细胞表位的多肽疫苗中都 具有非常重要的价值； 3、由于这些 T 细胞表位其限制性的 HLA 等位基因型 在中国南方人群中占有较高的比率，因此，这些表位具有广泛的人群覆盖性和 潜在的广阔的应用前景。 背景： 登革病毒(DEN)为黄病毒属的单股正链 RNA 病毒，包括 4 个血清型。 DEN 感染一般引起登革热(DF)，严重时引起登革出血热(DHF)和登革休克综合症 (DSS)。自从 1978 年广东省佛山地区和广州地区重现 DF 以来，每隔几年广州地 区都有不同程度的 DF 流行。DF 的流行(尤其是 DHF/DSS)严重危害了本地区人们 的健康和经济的发展。目前，对 DHF/DSS 的发病机理不清楚(尤其是 T 细胞免疫反应在其中所起的作用)严重阻碍了 DEN 疫苗的研发。感染 DEN 或接受候选 DEN 疫苗后，机体内产生了 DEN 血清型特异性 T 细胞和血清型间交叉反应性 T 细胞。 研究表明，DEN 血清型特异性 T 细胞免疫反应可以保护机体免受同型病毒的再 次感染，而 DEN 血清型间交叉反应性 T 细胞免疫反应不但能清除病毒、抑制其 复制而且参与了 DHF/DSS 的发病。T 细胞表位是激发 T 细胞免疫的必备因素， 因此鉴定并研究 DEN 特异性 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 的发病机理、研发基 于登革 T 细胞表位的多肽疫苗都具有重要的作用。 目的： 筛选 DEN 特异 性 T 细胞表位并进行免疫学特性的研究；分析各表位的潜在应用价值，为 DHF/DSS 发病机理的阐明和登革 T 细胞表位多肽疫苗的研制奠定基础。 方法：应用 RT-PCR、5RACE(Rapid amplication of cDNA ends)和 3RACE 技术 对 2002 年从广州分离的一株 DEN-1(71/GZ02 株)进行全序列测定；应用 Mega 4.0 系统进化分析软件对 71/GZ02 株同历年广东省内分离的 DEN-1 株及世界上其他 地方分离的 DEN-1 株的进化关系进行分析，从而为本课题中 T 细胞表位预测选 择地方代表株；基于 71/GZ02 株，GZ/80 株及 DEN-1、2、3、4 的一些参考株， 利用 Rankpep 在线软件预测 DEN 特异性 T 细胞表位；选择在 DEN-1 或多种 DEN 血清型分离株中保守并且预测的其限制性的 HLA-或类分子的等位基因型在 中国南方人群中占较高比率的 T 细胞表位作为候选表位，并以此合成多肽；分 离 DF(DEN-1 感染引起)恢复者的 PBMCs(Peripheralblood mononuclear cells外周血单个核细胞)，用合成的多肽刺激 PBMCs，利用 ELISPOT(Enzeyme-linked immunospot assay，酶联免疫斑点试验)、ICS- FC(Intracellular cytokinestaining and flow cytometry，细胞内细胞因子 染色/流式细胞术)和 ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，酶联免疫吸 附试验)技术检测 IFN- 分泌细胞数目及细胞培养上清中 IFN- 的产生量，从 而确定 DEN 特异性 T 细胞表位；对 DF 恢复者进行 HLA 分型，进而确定 DEN 特异 性 T 细胞表位其限制性的 HLA 等位基因型。 结论： 1、71/GZ02 株对广州 地区 DEN-1 分离株具有较好的代表性； 2、首次在国内利用生物信息学技术 结合体外免疫学试验确定了 9 条 DEN 特异性 T 细胞表位。这 9 条 T 细胞表位包 括在单一 DEN 血清型中保守的表位和在多种 DEN 血清中保守的表位，提示这些 T 细胞表位对于探讨 DHF/DSS 发病机理和研发基于 T 细胞表位的多肽疫苗中都 具有非常重要的价值； 3、由于这些 T 细胞表位其限制