微生物学专业优秀论文微生物学专业优秀论文 盐藻盐藻 NAD-3-NAD-3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因功磷酸甘油脱氢酶同工酶基因功能域的克隆及功能鉴定能域的克隆及功能鉴定关键词：盐生杜氏藻关键词：盐生杜氏藻 原核表达原核表达 3-3-磷酸甘油脱氢酶磷酸甘油脱氢酶 实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR摘要：植物在受到高盐(高渗)、干旱和寒冷等胁迫时，体内会产生并积累大量 的调渗物以改变细胞的渗透压，防止细胞过度失水。盐生杜氏藻(Dunaliella salina，简称盐藻 Ds)是目前发现的世界上最耐盐的真核光合生物，可以在 0.15.5mol/L NaCl 的环境中生存。盐藻作为一种典型的嗜盐生物，调渗物的 合成是其主要的耐盐策略。其适应外界高盐环境主要是通过甘油的合成与转化 来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小。盐藻细胞内甘油含量与外部 NaCl 浓 度呈线性关系。其甘油代谢的基本过程与酵母细胞中的十分类似，在此代谢途 径中，NAD-3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，简称 GPD)是甘油合成途径中的关键酶，它在 NADH 的参与下可催化磷酸二羟基丙酮向 3-磷酸甘油的转化。 3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)具有多种同工酶形式，广泛的 存在于生物体中发挥不同的作用。酿酒酵母(Saccharomvcesr cerevisiae)细胞 中存在三种 GPD 同工酶；拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也有三种 GPD 同工 酶；杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)GPD 同工酶的研究侧重于其天然蛋白的分 离和纯化，现已发现三种以 NAD 为辅基的 GPD 同工酶；果蝇(Drosophila melanogaster)中存在相同结构基因编码的三种不同 NAD-GPD 同工酶。盐生杜氏 藻(Dunaliella salina)中也存在多种 GPD 同工酶。 在实验室前期工作中， 我们首次在基因水平上对盐藻 GPD 同工酶进行研究。得到了 3 条 GPD 同工酶基 因的 EST 序列，经过比对将其分别命名为 NAD-GPD1、NAD-GPD2 和 FAD-GPD。实 验室的前期工作主要侧重于 NAD-GPD2 的研究，已成功克隆了它的全长基因并己 申请专利。在对其进行功能域搜索时发现，GPD2 基因同时包含了 3-磷酸甘油脱 氢酶(GPD)和 3-磷酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，在其他物种的 3- 磷酸甘油脱氢酶中均未发现如此特殊的结构。因此，我们推测这可能是盐藻具 有极高甘油合成能力的关键所在，即 DHAP 在盐藻 NAD-GPD2 具有的 GPD 和 GPP 两个活性中心的作用下可以直接合成甘油，这样就可以大大提高盐藻甘油合成 的效率。这个推测已经被我们通过 Southem blot、Northern blot、Western blot 和重组蛋白酶学特性的研究得到了初步的证实，相关的文章发表在 Joumal of Plant Physiology杂志上。在接下来的实验中，我们欣喜的发 现盐藻 NAD-GPD1 同工酶基因经预测也同样具有 3.磷酸甘油脱氢酶(GPD)和 3-磷 酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，看起来盐藻的 NAD-GPD 同工酶基因 在结构上都具有这两个独立完整的功能域，那么它们在盐藻响应渗透胁迫时是 如何分工协作，发挥其各自的调渗机制的呢?这就是本论文的研究目的。本论文 从基因和蛋白水平上分别对 DsGPD1 进行了研究，具体内容如下： 1、盐藻 GPD1 不同功能域基因片段的克隆。通过 RT-PCR 的方法分别克隆得到 DsGPD1 的 两个不同功能域的基因片段，GPD1.8 和 GPD1.1，并对其进行了相应的生物信息 学分析，为证明盐藻中确实存在 NAD-GPD1 基因的不同功能域提供实验证据。此 处为了方便表述，根据基因长度，把 DsGPD13-磷酸甘油磷酸酶和 3-磷酸甘油脱 氢酶两个功能域合在一起的基因片段命名为 GPD1.8，将 3-磷酸甘油脱氢酶这一 个功能域的基因片段命名为 GPD1.1。 2、盐藻 GPD1 不同功能域基因片段GPD1.8 和 GPD1.1 的原核表达及体外酶活测定。将 GPD1.1 功能域克隆至大肠杆 菌表达载体 pET-32a 中，进行原核表达，进而仿照 Dunaliella tertiolecta NAD-3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的研究方法，测定不同浓度 NaCl 和 DTT 对 DsGPD1 3-磷酸甘油脱氢酶活性的影响。另外，将 GPD1.8 功能域同样进行原核 表达，进而体外测定其 GPD 和 GPP 双功能酶活，为 DsGPD1 的功能验证提供实验 证据。 3、通过真核生物酿酒酵母体内功能互补实验，验证盐藻 GPD1 的功能。 将盐藻 GPD1 基因的不同功能域片段，GPD1.8 和 GPD1.1 分别克隆至酿酒酵母表 达载体 pYES2 中，获得重组质粒 pYES-GPD1.8 和 pYES-GPD1.1，然后通过电击 转化的方法将重组质粒分别转入酿酒酵母 GPD1 菌株中，在高盐棉子糖培养基 中添加半乳糖诱导克隆基因的表达，观察 DsGPD1 基因在耐盐方面对缺陷型酿酒 酵母的 GPD1 基因所起到的互补作用的大小，通过真核体内功能互补为 DsGPD1 的功能验证提供实验证据。 4、研究了盐藻处于不同胁迫时，其 DsGPD1 mRNA 的差异表达情况。利用实时荧光定量 PCR 的方法，研究了经高盐、磷酸盐、 氧化以及厌氧等不同外界胁迫作用下盐藻该基因的表达变化情况，为进一步研 究盐藻各种 3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因在细胞内的分工奠定基础。正文内容正文内容植物在受到高盐(高渗)、干旱和寒冷等胁迫时，体内会产生并积累大量的 调渗物以改变细胞的渗透压，防止细胞过度失水。盐生杜氏藻(Dunaliella salina，简称盐藻 Ds)是目前发现的世界上最耐盐的真核光合生物，可以在 0.15.5mol/L NaCl 的环境中生存。盐藻作为一种典型的嗜盐生物，调渗物的 合成是其主要的耐盐策略。其适应外界高盐环境主要是通过甘油的合成与转化 来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小。盐藻细胞内甘油含量与外部 NaCl 浓 度呈线性关系。其甘油代谢的基本过程与酵母细胞中的十分类似，在此代谢途 径中，NAD-3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，简称 GPD)是甘油合成途径中的关键酶，它在 NADH 的参与下可催化磷酸二羟基丙酮向 3-磷酸甘油的转化。 3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)具有多种同工酶形式，广泛的 存在于生物体中发挥不同的作用。酿酒酵母(Saccharomvcesr cerevisiae)细胞 中存在三种 GPD 同工酶；拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也有三种 GPD 同工 酶；杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)GPD 同工酶的研究侧重于其天然蛋白的分 离和纯化，现已发现三种以 NAD 为辅基的 GPD 同工酶；果蝇(Drosophila melanogaster)中存在相同结构基因编码的三种不同 NAD-GPD 同工酶。盐生杜氏 藻(Dunaliella salina)中也存在多种 GPD 同工酶。 在实验室前期工作中， 我们首次在基因水平上对盐藻 GPD 同工酶进行研究。得到了 3 条 GPD 同工酶基 因的 EST 序列，经过比对将其分别命名为 NAD-GPD1、NAD-GPD2 和 FAD-GPD。实 验室的前期工作主要侧重于 NAD-GPD2 的研究，已成功克隆了它的全长基因并己 申请专利。在对其进行功能域搜索时发现，GPD2 基因同时包含了 3-磷酸甘油脱 氢酶(GPD)和 3-磷酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，在其他物种的 3- 磷酸甘油脱氢酶中均未发现如此特殊的结构。因此，我们推测这可能是盐藻具 有极高甘油合成能力的关键所在，即 DHAP 在盐藻 NAD-GPD2 具有的 GPD 和 GPP 两个活性中心的作用下可以直接合成甘油，这样就可以大大提高盐藻甘油合成 的效率。这个推测已经被我们通过 Southem blot、Northern blot、Western blot 和重组蛋白酶学特性的研究得到了初步的证实，相关的文章发表在 Joumal of Plant Physiology杂志上。在接下来的实验中，我们欣喜的发 现盐藻 NAD-GPD1 同工酶基因经预测也同样具有 3.磷酸甘油脱氢酶(GPD)和 3-磷 酸甘油磷酸酶(GPP)两个独立完整的功能域，看起来盐藻的 NAD-GPD 同工酶基因 在结构上都具有这两个独立完整的功能域，那么它们在盐藻响应渗透胁迫时是 如何分工协作，发挥其各自的调渗机制的呢?这就是本论文的研究目的。本论文 从基因和蛋白水平上分别对 DsGPD1 进行了研究，具体内容如下： 1、盐藻 GPD1 不同功能域基因片段的克隆。通过 RT-PCR 的方法分别克隆得到 DsGPD1 的 两个不同功能域的基因片段，GPD1.8 和 GPD1.1，并对其进行了相应的生物信息 学分析，为证明盐藻中确实存在 NAD-GPD1 基因的不同功能域提供实验证据。此 处为了方便表述，根据基因长度，把 DsGPD13-磷酸甘油磷酸酶和 3-磷酸甘油脱 氢酶两个功能域合在一起的基因片段命名为 GPD1.8，将 3-磷酸甘油脱氢酶这一 个功能域的基因片段命名为 GPD1.1。 2、盐藻 GPD1 不同功能域基因片段 GPD1.8 和 GPD1.1 的原核表达及体外酶活测定。将 GPD1.1 功能域克隆至大肠杆 菌表达载体 pET-32a 中，进行原核表达，进而仿照 Dunaliella tertiolecta NAD-3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的研究方法，测定不同浓度 NaCl 和 DTT 对 DsGPD1 3-磷酸甘油脱氢酶活性的影响。另外，将 GPD1.8 功能域同样进行原核表达，进而体外测定其 GPD 和 GPP 双功能酶活，为 DsGPD1 的功能验证提供实验 证据。 3、通过真核生物酿酒酵母体内功能互补实验，验证盐藻 GPD1 的功能。 将盐藻 GPD1 基因的不同功能域片段，GPD1.8 和 GPD1.1 分别克隆至酿酒酵母表 达载体 pYES2 中，获得重组质粒 pYES-GPD1.8 和 pYES-GPD1.1，然后通过电击 转化的方法将重组质粒分别转入酿酒酵母 GPD1 菌株中，在高盐棉子糖培养基 中添加半乳糖诱导克隆基因的表达，观察 DsGPD1 基因在耐盐方面对缺陷型酿酒 酵母的 GPD1 基因所起到的互补作用的大小，通过真核体内功能互补为 DsGPD1 的功能验证提供实验证据。 4、研究了盐藻处于不同胁迫时，其 DsGPD1 mRNA 的差异表达情况。利用实时荧光定量 PCR 的方法，研究了经高盐、磷酸盐、 氧化以及厌氧等不同外界胁迫作用下盐藻该基因的表达变化情况，为进一步研 究盐藻各种 3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因在细胞内的分工奠定基础。 植物在受到高盐(高渗)、干旱和寒冷等胁迫时，体内会产生并积累大量的调渗 物以改变细胞的渗透压，防止细胞过度失水。盐生杜氏藻(Dunaliella salina，简称盐藻 Ds)是目前发现的世界上最耐盐的真核光合生物，可以在 0.15.5mol/L NaCl 的环境中生存。盐藻作为一种典型的嗜盐生物，调渗物的 合成是其主要的耐盐策略。其适应外界高盐环境主要是通过甘油的合成与转化 来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小。盐藻细胞内甘油含量与外部 NaCl 浓 度呈线性关系。其甘油代谢的基本过程与酵母细胞中的十分类似，在此代谢途 径中，NAD-3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-