外科学专业毕业论文外科学专业毕业论文 精品论文精品论文 缺营养诱导的自噬和端粒酶在缺营养诱导的自噬和端粒酶在肝癌细胞对化疗药物不敏感中作用的研究肝癌细胞对化疗药物不敏感中作用的研究关键词：肝癌关键词：肝癌 缺营养诱导缺营养诱导 端粒酶端粒酶 化疗药物化疗药物 细胞自噬细胞自噬摘要：肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一，且 呈逐年上升之势，肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗，但中晚期患者 常失去手术机会。由于肝癌对化疗的不敏感，所以肝癌的化疗总体效果不佳。 因此研究肝癌对化疗的不敏感性对提高肝癌的疗效以及提高病人生存率有很重 要的意义。虽然目前对肝癌的耐药机制研究较多，但确切的机制仍不清楚。新 近的研究表明，细胞自噬端粒酶可能和肿瘤的耐药有关。 目的： 研究缺 营养诱导的自噬和端粒酶在肝癌细胞对化疗药物不敏感中的作用。 本实验主 要由以下两大部分组成： 第一部分，缺营养诱导的自噬在肝癌对化疗不敏感 中的作用 将肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、SMMC7721)培养在全营养和自噬诱导 培养基 EBSS(无氨基酸无血清)中，分别用化疗药物(5FU、顺铂)处理 12h，利用 cck8 法检测细胞活性，用 AnnxinV/PI 双染色来检测细胞死亡，以全营养和缺 营养情况下未用药的对照组为基准，比较不同营养情况下肝癌细胞在化疗药作 用下的死亡率。结果发现缺营养情况下肝癌细胞对化疗药物的敏感性降低。由 于缺血缺营养是细胞发生自噬的天然诱导剂，新近的研究表明自噬与肿瘤对化 疗不敏感有关，这些研究提示我们自噬可能参与了肝癌细胞对化疗的不敏感， 因此我们进一步研究肝细胞癌缺营养是否诱导了自噬的发生。 将肝癌细胞系 (HepG2、Hep3B、SMMC7721)培养在全营养和自噬诱导培养基 EBSS(无氨基酸无 血清)中，应用电子透射显微镜检测自噬小体，realtime PCR.检测和比较不同 营养情况下自噬基因(LC3、ATG5、ATG7、DRAM、beclinl 等)表达。同时我们也 利用转染 LC3-GFP 质粒检测和比较不同营养情况下肝癌细胞成点状绿色荧光的 数量；结果表明，肝癌细胞在缺营养情况下自噬小体的形成数量要高于全营养 情况，同时成点状绿色荧光的数量也明显增多。这些结果表明肝细胞癌在缺营 养情况下诱导了自噬的发生。 对肝癌自噬的进一步的研究还证实抑制自噬增 加肿瘤细胞在缺营养情况下的死亡率和对化疗的敏感性。将肝癌细胞系 (HepG2、Hep3B、SMMC7721)培养在全营养和自噬诱导培养基 EBSS(无氨基酸无 血清)中，预先应用自噬抑制剂(3MA、LN294002)作用 2h，分别用化疗药物 (5FU、顺铂)处理 12h，利用 cck8 法检测细胞活性，在倒置相差显微镜下观察 细胞形态的变化，用 AnnxinV/PI 双染色以及 DAPI 染色来检测细胞凋亡，比较 和观察在全营养、缺营养及缺营养加自噬抑制剂情况下，肿瘤细胞的死亡情况 以及在化疗药物作用下的死亡情况。结果发现在抑制自噬和缺营养的情况下， 肿瘤细胞死亡增加，同时肿瘤细胞对化疗药物的敏感性也增加。 综合上面的 实验结果，我们的研究表明自噬不但是肝癌细胞在缺营养情况下的生存机制之 一，同时也有助于肝癌细胞抵抗化疗的作用。但是目前关于自噬抵抗化疗的具 体机制还不是很清楚。自噬是体内唯一的一个降解细胞器的途径，所以大部分 的研究认为自噬可能通过降解受损的线粒体，防止促凋亡因子如细胞色素和凋 亡诱导因子(AIF)的扩散，以帮助细胞逃逸凋亡。同时研究也显示 p53 在肿瘤细 胞的自噬发生过程起到很重要的作用。因此在 p53 野生型的肝癌细胞中我们关 注线粒体和 p53 在自噬诱导肝癌细胞对化疗药物不敏感中的作用。 将肝癌细胞系培养在全营养和自噬诱导培养基 EBSS(无氨基酸无血清)中，抽取 RNA，应 用 realtime PCR 检测和比较不同营养情况下线粒体基因(Nd2、Nmel)的表达。 同时将 p53 野生型的肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721)预先应用 p53 抑制剂 PFT-a 作用 1h，然后继续培养在全营养和自噬诱导培养基 EBSS(无氨基酸无血清)中 24h。应用电子透射显微镜检测自噬小体的形成。同时我们也利用转染 LC3-GFP 质粒检测和比较 p53 抑制和未抑制情况下肝癌细胞成点状绿色荧光的数量；结 果表明，在缺营养情况下线粒体基因 Nd2 表达降低，表明线粒体数量减少：同 时肝癌细胞在缺营养联合 p53 抑制情况下自噬小体的形成数量低于 p53 未抑制 情况，同时成点状绿色荧光的数量也明显减少。进一步的研究还显示在 p53 抑 制联合缺营养的情况下，分别用化疗药物(5FU、顺铂)处理 24h，利用 cck8 法 检测细胞活性，在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化，用 AnnxinV/PI 双染 色以及 DAPI 染色来检测细胞凋亡，比较和观察在全营养、缺营养及缺营养加自 噬抑制剂情况下，肿瘤细胞的死亡情况以及在化疗药物作用下的死亡情况。结 果发现在抑制 p53 和缺营养的情况下，肿瘤细胞死亡增加，同时肿瘤细胞对化 疗药物的敏感性也增加。这个结果表明线粒体的减少以及 p53 的激活可能参与 了肝癌对化疗的不敏感。 第二部分，端粒酶在肝癌对化疗不敏感中的作用 端粒酶重新激活是癌变细胞一个带有普遍性意义的生物学标志，被认为是细胞 癌变的一个重要细胞生物学异常事件，是细胞永生化及肿瘤发生的关键步骤。 近年来大量的研究资料表明，端粒酶除了有延长端粒长度的功能外还有抗凋亡 作用，由于大多数化疗药物作用于肿瘤细胞是通过凋亡而实现，因此端粒酶的 抗凋亡效应在肿瘤对化疗的不敏感性中的作用愈来愈引起大家的关注。 在这 一部分研究中我们首先发现低浓度化疗药物顺铂诱导肝癌细胞端粒酶上调和 hTERT 表达的升高。肝癌细胞 7721 培养在含不同浓度化疗药物顺铂的培养基中 24h，抽提蛋白，利用 TRAP 法(端粒重复扩增法)检测和比较不同浓度顺铂作用 的 SMMC7721 细胞的端粒酶活性。Western blot 和 RT-PCR(逆转录-PCR)方法检 测和比较细胞中 hTERT 的表达情况；同时我们也利用已构建好的 hTERT 基因启 动子荧光素报告基因(hTERT promoter-luciferase reporter system)系统来检 测和比较 SMMC7721 细胞的端粒酶 hTERT 基因启动子活性；结果我们发现不同浓 度化疗药物顺铂对肝癌细胞 SMMC7721 其端粒酶的活性和 hTERT 基因的表达水平 的诱导有一个剂量依赖的关系。而且研究结果还表明药物诱导肝癌细胞端粒酶 的上调，其上调可能是由于端粒酶 hTERT 组分表达量的增加所致。端粒酶 hTERT 基因的表达是受多种转录因子调控的。进一步深入的研究发现低浓度顺 铂能上调 NF-B 活性以及 p65 组分的表达，抑制 NF-B 会损害低浓度顺铂对 端粒酶 hTERT 基因表达的上调作用。这表明转录因子 NF-B 参与了低浓度顺铂 对端粒酶 hTERT 基因表达的上调作用。 在本实验室以前进行的肝癌端粒酶相 关研究中，发现 HCC 的端粒酶阳性率为 85，明显高于癌旁组织、肝硬变组织 及慢性肝炎组织，而正常肝脏组织不表达端粒酶活性，认为端粒酶的表达可能 在 HCC 的发生发展中起到了关键的作用。由于端粒酶具有抗凋亡效应，同时结 合肝癌对化疗的不敏感，因此我们猜想低浓度顺铂诱导的端粒酶的升高参与肝 癌对化疗的不敏感。肝癌细胞 7721 培养在含低浓度 (1g/ml)化疗药物顺 铂的培养基中 24h，随后用 5-FU(65g/ml)和表柔比星(1g/ml)分别处理诱导 的和未诱导的 7721 细胞 24 小时；在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化， Western blot 检测 PARP 来指示细胞凋亡，结果发现诱导过的肝癌细胞 7721 的 存活率比未诱导的高，细胞出现变小、变圆和透亮等形态变化的较少；同时PARP 表达减少说明凋亡率减少。这些结果提示经低浓度顺铂诱导过的 SMMC7721 细胞比未诱导过的细胞显示出了更低的化疗药物的敏感性。近一步的实验还证 实抑制 hTERT 的表达提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。在体外的研究中发现 针对 hTERT 的 siRNA 能明显抑制 hTERT 蛋白的表达和 hTERT 启动子的活性：抑 制端粒酶 hTERT 能显著提高肿瘤细胞对化疗药物 5-FU、表柔比星和顺铂的敏感 性，表现在细胞 hTERT 抑制后，在药物作用下细胞死亡增加，DAPI 染色显示核 固缩、碎裂增多。接着我们在体内实验中发现了相似的现象，我们将肝癌细胞 系 7721 和 HepG2 种植 BALB/c 裸鼠皮下成瘤，然后直接将腺病毒注射到肿瘤内， 并联合腹腔注射顺铂，每隔 5 天一次，共 4 次，结果显示联合 hTERT 抑制和顺 铂作用能有效的抑制种植瘤的生长。 综上所述，本课题得出以下结论： 1、营养缺乏能诱导肝癌细胞激活自噬，自噬能诱导肝癌细胞对化疗不敏感，抑 制自噬能提高肿瘤细胞在缺营养情况下的死亡率以及对化疗的敏感性。 2、p53 参与了营养缺乏情况下肝癌细胞自噬的激活，抑制 p53 能提高肿瘤细胞 在营养缺乏情况下的死亡率以及对化疗的敏感性。 3、低浓度的顺铂能诱导 肝癌细胞端粒酶上调和 hTERT 表达的升高，这种升高受到 NF-B 的调控。 4、低浓度顺铂能诱导肝癌细胞对化疗药物的不敏感。抑制端粒酶 hTERT 的表达， 能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性，而能明显抑制肝癌细胞在体内的生长。 总之，我们的研究表明，自噬和端粒酶参与了肝癌细胞对化疗的不敏感，自噬 和端粒酶的激活可能是肝癌抵抗化疗的机制之一。正文内容正文内容肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一，且呈 逐年上升之势，肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗，但中晚期患者常 失去手术机会。由于肝癌对化疗的不敏感，所以肝癌的化疗总体效果不佳。因 此研究肝癌对化疗的不敏感性对提高肝癌的疗效以及提高病人生存率有很重要 的意义。虽然目前对肝癌的耐药机制研究较多，但确切的机制仍不清楚。新近 的研究表明，细胞自噬端粒酶可能和肿瘤的耐药有关。 目的： 研究缺营 养诱导的自噬和端粒酶在肝癌细胞对化疗药物不敏感中的作用。 本实验主要 由以下两大部分组成： 第一部分，缺营养诱导的自噬在肝癌对化疗不敏感中 的作用 将肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、SMMC7721)培养在全营养和自噬诱导培 养基 EBSS(无氨基酸无血清)中，分别用化疗药物(5FU、顺铂)处理 12h，利用 cck8 法检测细胞活性，用 AnnxinV/PI 双染色来检测细胞死亡，以全营养和缺 营养情况下未用药的对照组为基准，比较不同营养情况下肝癌细胞在化疗药作 用下的死亡率。结果发现缺营养情况下肝癌细胞对化疗药物的敏感性降低。由 于缺血缺营养是细胞发生自噬的天然诱导剂，新近的研究表明自噬与肿瘤对化 疗不敏感有关，这些研究提示我们自噬可能参与了肝癌细胞对化疗的不敏感， 因此我们进一步研究肝细胞癌缺营养是否诱导了自噬的发生。 将肝癌细胞系 (HepG2、Hep3B、SMMC7721)培养在全营养和自噬诱导培养基 EBSS(无氨基酸无 血清)中，应用电子透射显微镜检测自噬小体，realtime PCR.检测和比较不同 营养情况下自噬基因(LC3、ATG5、ATG7、DRAM、beclinl 等)表达。同时我们也 利用转染 LC3-GFP 质粒检测和比较不同营养情况下肝癌细胞成点状绿色荧光的 数量；结果表明，肝癌细胞在缺营养情况下自噬小体的形成数量要高于全营养 情况