内科学内科学( (肾病肾病) )专业毕业论文专业毕业论文 精品论文精品论文 肾小管上皮细胞白细胞肾小管上皮细胞白细胞介素介素 1313 和白细胞介素和白细胞介素 4 4 受体的表达及其在肾小管损伤中的作用受体的表达及其在肾小管损伤中的作用关键词：肾小球硬化关键词：肾小球硬化 蛋白尿蛋白尿 白细胞介素白细胞介素 肾小管上皮细胞肾小管上皮细胞 信号转导信号转导 转录激活转录激活摘要：局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS) 是常见的肾小球疾病，占我国成人原发性肾小球肾炎的 7.0，临床上表现为 大量蛋白尿，早期研究表明足细胞损伤与大量蛋白尿的产生密切相关，足细胞 受损、脱落构成肾小球硬化发生发展的关键环节。细胞免疫功能异常在 FSGS 发 病机制中起着重要作用，FSGS 患者 T 细胞释放的细胞因子可导致足细胞损伤， 其中 Th2 细胞因子，如 IL-13 和 IL-4 被认为可能是主要致病因子，在肾病综合 征复发患者，CD4+和 CD8+T 细胞的 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达升高，同时胞浆 IL-13 和 IL-4 蛋白水平表达也升高。原位杂交技术检测发现，FSGS 患者肾组织 中 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达增加，且肾小管间质区 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达量 与肾功能变化及 24h 尿蛋白排泄呈正相关。有研究表明，足细胞上表达 IL-13 受体和 IL-4 受体，IL-13 和 IL-4 与相应受体结合，可直接损伤足细胞骨架结 构，破坏细胞间连接蛋白，造成滤过膜通透性的破坏。 FSGS 患者足细胞损 伤的同时，常伴随肾小管上皮细胞损伤，这点在组织形态和功能上都有明确的 体现，并成为 FSGS 诊断和鉴别诊断的一个重要特点。既往的观点认为大量蛋白 尿致肾小管上皮细胞损伤、肾小球节段硬化致出球小动脉狭窄和相应肾单位缺 血性损伤、肾小球毛细血管襻和包曼囊壁粘连使尿液反渗入肾间质触发间质炎 症反应是 FSGS 肾小管间质损伤的原因，但这些机制可能造成的组织损伤及其转 归不足以完全解释临床上观察到的现象。部分表现为超大量蛋白尿(10g/24h) 的 FSGS 患者，尿蛋白谱分析往往是大分子和小分子蛋白混合存在，这种情况只 有在近曲肾小管吸收功能严重受损时才会发生；一些对治疗敏感的患者，在大 量蛋白尿缓解的同时，反映肾小管损伤的指标也迅速地得到改善，这类患者肾 活检病理常常伴有近端肾小管的急性损伤，于是我们推测，是否可能有一些导 致足细胞病变的因素同时直接攻击了肾小管上皮细胞，使其功能和结构发生改 变，进而触发后续的间质病变以及间质纤维化。既然乙证实 IL-13 和 IL-4 可通 过足细胞上 IL-13 受体和 IL-4 受体导致足细胞损伤，那么，我们推测，在 FSGS 患者肾小管上皮细胞损伤中可能也存在同样的分子发病机制。为探讨 IL- 13 和 IL-4 对近端肾小管上皮细胞的损伤作用，本研究借助人近端肾小管上皮 细胞系(HK2)，研究人近端肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的表达及 IL-13 和 IL-4 对肾小管上皮细胞的影响，并探讨其作用机制。 本研究由两 部分组成： 第一部分：肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的检测 目 的： 检测人近端肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的表达。 方法： 1细胞人近端肾小管上皮细胞系(HK2)购自 ATCC(CRL-2910TM)。 2用 RT- PCR 和免疫荧光方法分别从 mRNA 水平和蛋白质水平检测 HK2 细胞上 IL-13 受体 和 IL-4 受体的表达。 结果： 1RT-PCR 结果显示正常培养的 HK2 细胞有 IL-13型受体和 IL-4型受体的组成亚链-IL-13R1 和 IL-4R 的 mRNA 表达。2免疫荧光结果显示正常培养的 HK2 细胞有 IL-13型受体和 IL-4型受 体的组成亚链-IL-13R1 和 IL-4R 蛋白质表达，呈颗粒状均匀分布在 HK2 胞 浆中。 结论： 人近端肾小管上皮细胞表达 IL-13型受体和 IL-4型受体。 第二部分：IL-13 受体和 IL-4 受体在肾小管损伤中的作用 目的： 通过观察 IL-13 和 IL-4 对近端肾小管上皮细胞的损伤标志物 RANTES 以及信号 传导通路 JAK-STAT6 的影响情况，分析 IL-13 和 IL-4 对肾小管上皮细胞的损伤 作用，并探讨其机制。 方法： 1IL-13 和 IL-4 对 HK2 细胞的影响作用 用免疫荧光的方法观察分别用不同浓度(10ng/ml、50ng/ml 和 100ng/ml)的 IL- 13 和 IL-4 干预 HK2 细胞 12-48 小时后 HK2 损伤标志物 RANTES 的变化情况。 2IL-13 和 IL-4 对 HK2 细胞的损伤机制 1)Western blot 方法检测不同时间 -浓度的 IL-13 和 IL-4 分别干预 HK2 细胞后，JAK-STAT6 信号通路的活化情况。2) Western blot 方法检测 JAK-STAT6 信号通路特异性抑制剂-来氟米特对 IL-13 和 IL-4 作用 HK2 细胞的 JAK-STAT6 信号通路激活的影响。 3)用免疫 荧光的方法观察来氟米特对 IL-13 和 IL-4 作用 HK2 细胞后 RANTES 变化的影响。结果： 1IL-13 和 IL-4 呈时间-剂量依赖性影响近端肾小管上皮细胞 RANTES 的表达。50ng/ml IL-13、100ng/ml IL-4 作用 HK2 细胞 48h 后的损伤作 用最为明显。正常培养的 HK2 细胞 RANTES 呈阴性，50ng/ml IL-13 和 100ng/ml IL-4 干预 48 小时后，阳性细胞显著增多。 2IL-13 处理组的 JAK-STAT6 磷 酸化水平在 50ng/ml 作用 10min 时开始升高(磷酸化水平为对照组的 222.481.9)，在 50ng/ml20min 时达高峰，(磷酸化水平为对照组的 307.840.7)；IL-4 处理组的 JAK-STAT6 磷酸化水平亦在 50ng/ml 作用 10min 时开始升高(磷酸化水平为对照组的 294.059.7)，并于 100ng/ml20min 时达高峰，(磷酸化水平为对照组的 1618.0229.9)。 3来氟米特干预IL-13 处理组和来氟米特预干预+IL-4 处理组与阴性对照相 比，JAK-STAT6 磷酸化水平均无明显变化，磷酸化水平与阴性对照组相比分别 为： 43.60.4vs41.22.4，P0.05，20.60.8vs14.96.7， P0.05，无统计学差异；而较阳性对照 STAT6 磷酸化水平明显降低，相比分别 为： 43.60.4vs89.38.3，P0.01，20.61.4vs44.87.5， P0.05，均有统计学差异。 4来氟米特干预IL-13 处理组较 IL-13 处理 组、来氟米特干预IL-4 处理组较 IL-4 处理组，HK2 细胞 RANTES 的表达均显 著减弱，与阴性对照无明显差别。 结论： 1IL-13 和 IL-4 可通过人近 端肾小管上皮细胞上的相应受体造成细胞损伤，表现为 RANTES 表达增加。 2IL-13 和 IL-4 的上述作用与细胞内 JAK-STAT6 信号通路活化密切相关。正文内容正文内容局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是 常见的肾小球疾病，占我国成人原发性肾小球肾炎的 7.0，临床上表现为大 量蛋白尿，早期研究表明足细胞损伤与大量蛋白尿的产生密切相关，足细胞受 损、脱落构成肾小球硬化发生发展的关键环节。细胞免疫功能异常在 FSGS 发病 机制中起着重要作用，FSGS 患者 T 细胞释放的细胞因子可导致足细胞损伤，其 中 Th2 细胞因子，如 IL-13 和 IL-4 被认为可能是主要致病因子，在肾病综合征 复发患者，CD4+和 CD8+T 细胞的 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达升高，同时胞浆 IL- 13 和 IL-4 蛋白水平表达也升高。原位杂交技术检测发现，FSGS 患者肾组织中 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达增加，且肾小管间质区 IL-13 和 IL-4 mRNA 表达量与 肾功能变化及 24h 尿蛋白排泄呈正相关。有研究表明，足细胞上表达 IL-13 受 体和 IL-4 受体，IL-13 和 IL-4 与相应受体结合，可直接损伤足细胞骨架结构， 破坏细胞间连接蛋白，造成滤过膜通透性的破坏。 FSGS 患者足细胞损伤的 同时，常伴随肾小管上皮细胞损伤，这点在组织形态和功能上都有明确的体现， 并成为 FSGS 诊断和鉴别诊断的一个重要特点。既往的观点认为大量蛋白尿致肾 小管上皮细胞损伤、肾小球节段硬化致出球小动脉狭窄和相应肾单位缺血性损 伤、肾小球毛细血管襻和包曼囊壁粘连使尿液反渗入肾间质触发间质炎症反应 是 FSGS 肾小管间质损伤的原因，但这些机制可能造成的组织损伤及其转归不足 以完全解释临床上观察到的现象。部分表现为超大量蛋白尿(10g/24h)的 FSGS 患者，尿蛋白谱分析往往是大分子和小分子蛋白混合存在，这种情况只有 在近曲肾小管吸收功能严重受损时才会发生；一些对治疗敏感的患者，在大量 蛋白尿缓解的同时，反映肾小管损伤的指标也迅速地得到改善，这类患者肾活 检病理常常伴有近端肾小管的急性损伤，于是我们推测，是否可能有一些导致 足细胞病变的因素同时直接攻击了肾小管上皮细胞，使其功能和结构发生改变， 进而触发后续的间质病变以及间质纤维化。既然乙证实 IL-13 和 IL-4 可通过足 细胞上 IL-13 受体和 IL-4 受体导致足细胞损伤，那么，我们推测，在 FSGS 患 者肾小管上皮细胞损伤中可能也存在同样的分子发病机制。为探讨 IL-13 和 IL-4 对近端肾小管上皮细胞的损伤作用，本研究借助人近端肾小管上皮细胞系 (HK2)，研究人近端肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的表达及 IL-13 和 IL-4 对肾小管上皮细胞的影响，并探讨其作用机制。 本研究由两部分组成：第一部分：肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的检测 目的： 检 测人近端肾小管上皮细胞 IL-13 受体和 IL-4 受体的表达。 方法： 1细 胞人近端肾小管上皮细胞系(HK2)购自 ATCC(CRL-2910TM)。 2用 RT-PCR 和 免疫荧光方法分别从 mRNA 水平和蛋白质水平检测 HK2 细胞上 IL-13 受体和 IL- 4 受体的表达。 结果： 1RT-PCR 结果显示正常培养的 HK2 细胞有 IL- 13型受体和 IL-4型受体的组成亚链-IL-13R1 和 IL-4R 的 mRNA 表达。 2免疫荧光结果显示正常培养的 HK2 细胞有 IL-13型受体和 IL-4型受体的 组成亚链-IL-13R1 和 IL-4R 蛋白质表达，呈颗粒状均匀分布在 HK2 胞浆中。结论： 人近端肾小管上皮细胞表达 IL-13型受体和 IL-4型受体。 第二部分：IL-13 受体和 IL-4 受体在肾小管损伤中的作用 目的： 通过观 察 IL-13 和 IL-4 对近端肾小管上皮细胞的损伤标志物 RANTES 以及信号传导通 路 JAK-STAT6