血液病学专业优秀论文血液病学专业优秀论文 重组慢病毒载体介导的人凝血因子重组慢病毒载体介导的人凝血因子体外体外表达的研究表达的研究关键词：巨细胞病毒关键词：巨细胞病毒 重组慢病毒重组慢病毒 凝血因子凝血因子 基因重组基因重组 慢病毒表达慢病毒表达 血友病血友病摘要：目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的 B 区缺失的人凝血因子 (BDDhF)基因的重组慢病毒载体 pXZ208-BDDhF，观察 F活性在不同靶细 胞 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC 中的表达。 方法：采用 基因重组技术，用限制性内切酶 Xhol I 从质粒 pDLZ6 中将目的基因 BDDhF片 段切出，克隆至 pXZ208 的 Xhol I 位点，构建转移质粒 pXZ208-BDDhFHU，限制 性酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208- BDDhF与包装质粒 NRF、包膜蛋白质粒 VSV-G 共转染 293T 包装细胞，包装 后的病毒颗粒感染 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞。感 染 48h 后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测 BDDhF基因的转录、一期法检测 细胞培养上清 F的活性、流式细胞术(FCM)检测病毒的感染效率。感染后的靶 细胞传代培养，PCR 检测 BDDhF基因的整合。 结果：成功构建了慢病毒表 达载体 pXZ208-BDDhF，包装后，重组慢病毒能感染 293T、HLF、NIH3T3、MSC、mBMEC 和 Chang-Liver 细胞，其基因转导效率有差 异，分别为(59.575.24)、(74.527.57)、(41.335.82) 、(42.345.84)、(14.382.73)和(27.246.53)。RT-PCR 法能够检 测到 BDDhF基因的转录。 感染 48h 后即可检测到 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞上清中 F的表达， F 活性有差异，分别为(43.23.2)、(54.15.6)、(14.22.8) 、(8.71.3)、(22.52.9)和(12.52.7)。感染后的传代细胞中有 BDDhF基因的整合。 结论： 1.成功构建了 CMV 启动子驱动的人凝血因子 的慢病毒载体 pXZ208-BDDhF； 2.采用改良的磷酸钙沉淀法共转染三质 粒，制备高滴度的病毒，在未经超速离心的情况下，病毒滴度达到了 10lt;#39;6gt;数量级，能够满足体内实验的需要； 3.重组 慢病毒能够高效感染多种离体培养的细胞并表达有活性的 F； 4.慢病毒介 导的外源基因能够整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达奠定了基 础。正文内容正文内容目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的 B 区缺失的人凝血因子 (BDDhF)基因的重组慢病毒载体 pXZ208-BDDhF，观察 F活性在不同靶细 胞 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC 中的表达。 方法：采用 基因重组技术，用限制性内切酶 Xhol I 从质粒 pDLZ6 中将目的基因 BDDhF片 段切出，克隆至 pXZ208 的 Xhol I 位点，构建转移质粒 pXZ208-BDDhFHU，限制 性酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208- BDDhF与包装质粒 NRF、包膜蛋白质粒 VSV-G 共转染 293T 包装细胞，包装 后的病毒颗粒感染 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞。感 染 48h 后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测 BDDhF基因的转录、一期法检测 细胞培养上清 F的活性、流式细胞术(FCM)检测病毒的感染效率。感染后的靶 细胞传代培养，PCR 检测 BDDhF基因的整合。 结果：成功构建了慢病毒表 达载体 pXZ208-BDDhF，包装后，重组慢病毒能感染 293T、HLF、NIH3T3、MSC、mBMEC 和 Chang-Liver 细胞，其基因转导效率有差 异，分别为(59.575.24)、(74.527.57)、(41.335.82) 、(42.345.84)、(14.382.73)和(27.246.53)。RT-PCR 法能够检 测到 BDDhF基因的转录。 感染 48h 后即可检测到 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞上清中 F的表达， F 活性有差异，分别为(43.23.2)、(54.15.6)、(14.22.8) 、(8.71.3)、(22.52.9)和(12.52.7)。感染后的传代细胞中有 BDDhF基因的整合。 结论： 1.成功构建了 CMV 启动子驱动的人凝血因子 的慢病毒载体 pXZ208-BDDhF； 2.采用改良的磷酸钙沉淀法共转染三质 粒，制备高滴度的病毒，在未经超速离心的情况下，病毒滴度达到了 10lt;#39;6gt;数量级，能够满足体内实验的需要； 3.重组 慢病毒能够高效感染多种离体培养的细胞并表达有活性的 F； 4.慢病毒介 导的外源基因能够整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达奠定了基 础。 目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的 B 区缺失的人凝血因子(BDDhF)基 因的重组慢病毒载体 pXZ208-BDDhF，观察 F活性在不同靶细胞 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC 中的表达。 方法：采用基 因重组技术，用限制性内切酶 Xhol I 从质粒 pDLZ6 中将目的基因 BDDhF片段 切出，克隆至 pXZ208 的 Xhol I 位点，构建转移质粒 pXZ208-BDDhFHU，限制性 酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208- BDDhF与包装质粒 NRF、包膜蛋白质粒 VSV-G 共转染 293T 包装细胞，包装 后的病毒颗粒感染 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞。感 染 48h 后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测 BDDhF基因的转录、一期法检测 细胞培养上清 F的活性、流式细胞术(FCM)检测病毒的感染效率。感染后的靶 细胞传代培养，PCR 检测 BDDhF基因的整合。 结果：成功构建了慢病毒表 达载体 pXZ208-BDDhF，包装后，重组慢病毒能感染 293T、HLF、NIH3T3、MSC、mBMEC 和 Chang-Liver 细胞，其基因转导效率有差 异，分别为(59.575.24)、(74.527.57)、(41.335.82) 、(42.345.84)、(14.382.73)和(27.246.53)。RT-PCR 法能够检 测到 BDDhF基因的转录。 感染 48h 后即可检测到293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞上清中 F的表达， F 活性有差异，分别为(43.23.2)、(54.15.6)、(14.22.8) 、(8.71.3)、(22.52.9)和(12.52.7)。感染后的传代细胞中有 BDDhF基因的整合。 结论： 1.成功构建了 CMV 启动子驱动的人凝血因子 的慢病毒载体 pXZ208-BDDhF； 2.采用改良的磷酸钙沉淀法共转染三质 粒，制备高滴度的病毒，在未经超速离心的情况下，病毒滴度达到了 10lt;#39;6gt;数量级，能够满足体内实验的需要； 3.重组 慢病毒能够高效感染多种离体培养的细胞并表达有活性的 F； 4.慢病毒介 导的外源基因能够整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达奠定了基 础。 目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的 B 区缺失的人凝血因子(BDDhF)基 因的重组慢病毒载体 pXZ208-BDDhF，观察 F活性在不同靶细胞 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC 中的表达。 方法：采用基 因重组技术，用限制性内切酶 Xhol I 从质粒 pDLZ6 中将目的基因 BDDhF片段 切出，克隆至 pXZ208 的 Xhol I 位点，构建转移质粒 pXZ208-BDDhFHU，限制性 酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208- BDDhF与包装质粒 NRF、包膜蛋白质粒 VSV-G 共转染 293T 包装细胞，包装 后的病毒颗粒感染 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞。感 染 48h 后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测 BDDhF基因的转录、一期法检测 细胞培养上清 F的活性、流式细胞术(FCM)检测病毒的感染效率。感染后的靶 细胞传代培养，PCR 检测 BDDhF基因的整合。 结果：成功构建了慢病毒表 达载体 pXZ208-BDDhF，包装后，重组慢病毒能感染 293T、HLF、NIH3T3、MSC、mBMEC 和 Chang-Liver 细胞，其基因转导效率有差 异，分别为(59.575.24)、(74.527.57)、(41.335.82) 、(42.345.84)、(14.382.73)和(27.246.53)。RT-PCR 法能够检 测到 BDDhF基因的转录。 感染 48h 后即可检测到 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞上清中 F的表达， F 活性有差异，分别为(43.23.2)、(54.15.6)、(14.22.8) 、(8.71.3)、(22.52.9)和(12.52.7)。感染后的传代细胞中有 BDDhF基因的整合。 结论： 1.成功构建了 CMV 启动子驱动的人凝血因子 的慢病毒载体 pXZ208-BDDhF； 2.采用改良的磷酸钙沉淀法共转染三质 粒，制备高滴度的病毒，在未经超速离心的情况下，病毒滴度达到了 10lt;#39;6gt;数量级，能够满足体内实验的需要； 3.重组 慢病毒能够高效感染多种离体培养的细胞并表达有活性的 F； 4.慢病毒介 导的外源基因能够整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达奠定了基 础。 目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的 B 区缺失的人凝血因子(BDDhF)基 因的重组慢病毒载体 pXZ208-BDDhF，观察 F活性在不同靶细胞 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC 中的表达。 方法：采用基 因重组技术，用限制性内切酶 Xhol I 从质粒 pDLZ6 中将目的基因 BDDhF片段 切出，克隆至 pXZ208 的 Xhol I 位点，构建转移质粒 pXZ208-BDDhFHU，限制性 酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208- BDDhF与包装质粒 NRF、包膜蛋白质粒 VSV-G 共转染 293T 包装细胞，包装 后的病毒颗粒感染 293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver 和 MSC 细胞。感染 48h 后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测 BDDhF基因的转录、一期法检测 细胞培养上清 F的活性、流式细胞术(FCM)检测病