高速逆流色谱分离纯化抗生素郑 卫（福建省微生物研究所 福州 350007）内 容 提 要一 高速逆流色谱技术简介 二 溶剂选择 在逆流色谱中的重要性三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例一 高速逆流色谱技术简介 高速逆流色谱(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)a 多层盘绕管；b 平衡物优缺点（与HPLC等液-固色谱技术比较)优点 分离原理不同：互补性强 无需固体作固定相 ：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、 变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂 贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的1/10以下），运行使 用的后续投入较低 溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相 从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负 载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积100mL， 一次分离量：0.5-2克盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60克 缺点 分离效率（理论塔板数）还不高（1.5 溶剂系统： 固定相保留率：75% 表1 最佳溶剂体系选择表 极性较弱溶剂 最佳溶剂 极性较强溶剂 heptane, CHCl3 THF H2O heptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2O heptane methyl ethyl ketone H2O THF DMSO H2O toluene, MtBE, MiBK, EtOAc MeCN H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc BuOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2O heptane, CHCl3, EtOAc EtOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2O heptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2O CHCl3 HCOOH H2O非水体系 Heptane THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH, MeCN逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图Type 1: Chloroform / Methanol / Water 应用：杆菌肽，Niphimycin，克念菌素 ，Herbicidins A, B等lType 2. Ethyl acetate / butanol / Waterl应用：WAP-8294A ，弱极性样品Type 0: Water /Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 应用：极性强的难溶性样品如两性霉素B CPC separation of Amphotericin B(peak 7)Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2, V/V/V)溶剂系统的选择与优化 步骤1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:00:100）用 HPLC对样品进行极性扫描分析 ，得到样品的极性范围步骤2:溶剂系统 的优化区域 化合物极性 溶剂系统 A 强极性 正己烷/正丁醇/甲醇/水B 中极性 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水C 非极性 正己烷/乙腈步骤3:溶剂比例的优化一次只改变一种溶剂的量取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分离Sporaviridins A1 A2 B1 B2 C1 C2R1 H H H H OH OHR2 OH OH NH2 NH2 OH OHR3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3孢绿菌素：碱性，水溶性，抗G+菌和毛癣癣菌等。 化学结构：含七个糖元的34元大环内酯化合物，主要有6个组分 ，由于结构非常相似，用HPLC等方法难以分离。 溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。 HSCCC方法： 溶剂系统选择： 正丁醇/水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿 菌素在上相中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和 乙醚。 正丁醇/乙醚/水：先固定正丁醇和水的体积（各10mL)，加入不 同体积的乙醚，发现10：4：10（V/V/V)效果较好。再固定正 丁醇/乙醚10：4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为 10：4：12。 HSCCC：固定相保留率：75%，分离时间：3.5h，洗脱体积： 500mL 分离前粗品15mg，分离后分别得到纯组分A1(1.4mg), A2(0.6mg), B1(0.7mg), B2(0.5mg), C1(1.1mg), C2(1.4mg)。HPLC separation of sporaviridins. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium chloride (74:26,v/v), flow rate:1ml/min, detection: 232 nm. 孢绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数分配系数（U/L） 正丁醇/乙醚/水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.34 4.1910:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.9110:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.1210:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.7010:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.8210:4:11 0.31 0.89 1.24 0.70 1.50 2.0010:4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.3210:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.1010:4:14 0.29 1.09 1.17 0.57 1.22 1.74lHPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium choride (74:26, v/v), folw rate: 1ml/min,detection: 232 nm. 三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例 文献报道： 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 肽类 短杆菌肽A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982 多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol) LP 1991 杆菌肽 CHCl3-MeOH-H2O LP 1991CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991 WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 放线菌素类 放线菌素混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 大环内酯类 2-去甲基红霉素 nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH-0.01M citrate buffer(pH6.3) UP 1988 尼达霉素 CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer