第三章 园艺植物组织培养内 容（4学时） 第一节 概说 第二节 园艺植物组织培养的应用 第三节 园艺植物原生质体培养和体细胞杂交 第四节 原生质体融合与园艺植物改良培养室能控制光照和温度，保持干燥 和清洁园艺植物组织培养小鳞芽反绿后开始生长生根 观赏百合组织培养第一节 概说 一、园艺植物组织培养的意义 园艺植物组织培养是园艺学不可或缺 的一个重要组成部分，为园艺植物的 各个基础学科的研究和发展提供了强 有力的手段，在园艺学的基础理论研 究方面占有重要的地位，在园艺产业 中具有广泛的应用前景。园艺植物组 织培养技术及理论研究的发展对提高 园艺植物生产水平和技术水平，加速 园艺科学现代化的进程具有重要作用 。 植物组织培养作为一门生物技术近30年发 展迅速，广泛应用于农业、园艺、林业、 医药。农业生产中进行优良植物种类的快 速繁殖，脱除病毒和辅助育种等，并产生 巨大的经济效益。现代农业必须用生物技 术“提升”，“植物组织培养”就是用生物技术 提升农业的重要科学手段。园艺植物离体无性繁殖 简称离体繁殖（in vitro propagation)、微 型繁殖（micropropagation)，是指利用离体 培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶 片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养 ，并在短期内获得大量遗传性一致的个体的 方法（技术）。 用这种方法得到的植株群体来自一个单株（ 或一个单芽），它们遗传组成相同，这些株 群可称单株无性系。 近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子 西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛 应用。园艺植物离体无性繁殖的意义（优越性 ）繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受季节限制， 便于工厂化育苗繁殖各种珍稀、涉危苗木和 突变体，为育种服务 离体繁殖周期： 13个月 繁殖系数：几十 几百倍 又称快繁 离体繁殖是建立在 体细胞系的基础上 ，是在人工控制的 环境条件下，不会 造成性状分离，也 不会退化，同时还 可避免病虫害的侵 染。手指玫瑰 菊花的组培快繁（一）外植体材料选择与灭菌选取长势健壮的植株作为外植体母株，以培养出大量的无病植株。 在外植体的选择上，可以选取生长健壮嫩茎和叶片作为材料。流水洗去表面灰尘，在超净工作台用75 %酒精处理2030 s，再用无菌水冲洗35 次，转入0.1 %升汞溶液浸泡710 min，再用无菌水冲洗46 次，用滤纸吸干水分。（二）诱导、继代培养在无菌条件下，用剪刀将外植体茎段切成0. 51 cm 长小段，水平放置接种；叶片切成5mm5mm小块，下表皮朝下水平放置接入初代培养基中，接种完成后即转入培养室进行初代培养，培养温度2228 ，光强10004000 Lx。1.间接再生途径茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周 内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。20d后 产生愈伤组织，30d愈伤组织分化出芽。2.直接再生途径茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。但是 20d后不产生愈伤组织，直接分化出芽。菊花再生植株（三）生根、移栽当培养基中的植株出芽后，再将其转入到生根培养基中，诱导其生根。或通过无根嫩茎扦插生根。1.试管生根切取3cm左右无根嫩茎，转插到1/2MS+NAA0.1培养基中，经两周即可生根，然后移栽驯化。移栽初期保持高湿度条件，营养钵基质浇透水，取出生根的试管苗，洗掉附加在根部的培养基，用竹签在基质上打一小孔，将幼苗插入基质中。然后家设小拱棚以保湿，随着幼苗的生长，逐渐降低空气湿度和基质含水量，转为正常的管理阶段。2.扦插生根利用菊花无根嫩茎易于生根的特点，也可免去试管生根这道程序。剪取23cm无根苗，插植到珍珠岩或蛭石的基质中，基 质事先用生根激素溶液浸透，10d后生根率可达95%100%。菊花炼苗菊花移栽苗园艺植物离体无性繁殖的方式 器官发生型(organogenesis type) 胚状体发生型(embryogenesis type) 不定芽型（adventitious bud type) 器官型(organ type) 原球茎型(protocorm type) 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型 根茎型 微枝扦插型 器官发生型(organogenesis type)： 诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培 养形成芽、根再生成植株的方式。 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早 期挑选，使其来源尽量一致。 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再 生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。芦荟、烟草、油菜等 无菌母株制备增殖、分化植株再生及鉴定炼苗和移植基本程序与技术培养基中激素配比激素种类及浓度基本培养基组成渗透压逐步过渡培养基筛选材料灭菌芦荟组织培养快速繁殖 材料和培养基1015cm高的芦荟幼苗愈伤组织诱导培养基 MS(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA分化培养基 MS(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培养基 MS(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑繁殖方法 愈伤组织培养 外植体：茎尖外植体消毒：酒精升汞培养基：愈伤组织诱导培养基培养条件：温度 252光照 10002000lx 1012h/d培养时间 1525d （形成愈伤）繁殖方法 继代培养种子 愈伤切块培养基及条件 同愈伤组织培养培养时间 1030 分化培养种子 愈伤切块培养基 分化培养基培养条件 同愈伤组织培养培养时间 3050d （出芽，叶） 生根培养材料 3cm高的幼苗培养基 生根培养基培养条件 同愈伤培养培养时间 15d 炼苗 选材 苗高510cm，健壮清洗培养基，喷水 条件 15 25，6080湿度，1224h 移栽移入驯化苗圃（蛭石组成） 1520d 移入苗圃胚状体发生型(embryogenesis type)： 指园艺植物器官、组织和细胞外植体经培 养脱分化形成胚状体再成苗的方式。 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及 萌发率和提高胚状体同步化率。 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构 完整，繁殖系数高；遗传性稳定。甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 胚状体（embryoid）：指在组织培养中， 由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和 胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形 胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有 双极性的胚状结构。合子心型胚 正在萌发的体胚合子胚与体胚比较针叶松体细胞胚及体胚萌发生长花椰菜体胚发育的不同阶段菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察不定芽型（adventitious bud type)： 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植 株的方式。 技术关键：打破顶端优势， 促使腋芽增殖并促其生根。 特点：繁殖率高、保持物种 的遗传稳定性，多用于林木 的繁殖。器官型(organ type) 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不 定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 技术关键：对培养基要求高，控制好激素 浓度，避免愈伤组织发生。 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定 。 三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、 丝石竹等 原球茎型(protocorm type) 兰属特有的方式， 即外植体经培养产 生原球茎，再直接 长成植株。 原球茎：兰科植物组织培养中形成的一种 特殊的中间繁殖体，是呈珠粒状、由胚性 细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官 。圆球茎可以增殖形成原球茎丛。球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一 端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种 植 唐菖蒲观 叶 海 棠块茎型 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分 化出芽和根 块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖 移栽，成活率高 。 花叶芋 鳞茎型 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合 郁金香孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时 间较长 地钱狼尾蕨根茎型 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为 组织培养的最佳外植体。 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢 子型快 肾蕨等 微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树 1、快繁利用适宜的植物材料(外植体)，通过组织培 养的途径，使之分生出新的植株个体，即 为组培苗。这种繁殖方式称为微繁或快繁 。二、园艺植物组织培养的意义微繁有许多优势 繁殖速度快，通常一年内可以繁殖数以万计的 ，较为整齐一致的种苗，大大提高繁殖系数。特 别对于难繁殖的园艺植物的名贵品种、稀有种质 的繁殖推广具有重要意义。一个兰花的茎尖一年 内可育成400万个原球茎，一个草莓茎尖一年内 可育出成苗3000万株。 占用空间小，一间30平方米的培养室可以放置 一万多个瓶子，足以同时繁殖几万株种苗。 可以培养脱毒种苗。 器官培养为无性繁殖，可以最大限度的保存种 质。 （1）培育单倍体提高育种效率，改良品种 花药培养：把发育到一定阶段的花药接 种在人工培养基上，使其发育和分化成 植株的过程 花粉培养：从花药中分离出花粉粒使之 成为分散或游离的状态，通过培养使其 脱分化并发育成植株的过程 目的是获得单倍体植株 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实 际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 固液双层培养花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养7天14天213040后曼陀罗的花药培养一、胚培养的类型：分为成熟胚培养和幼胚培养两种。(2)园艺植物胚与胚乳培养第四章 胚胎培养和胚乳培养被子植物双受精（double fertilization):二倍体合子 三倍体胚乳 幼胚培养: Hanning（1904）；Laibach（1925 ）最先付诸应用的植物细胞工程技术：20 世纪20年代建立的幼胚培养和胚胎拯救（ embryo rescue)技术中国学者在裸子植物胚胎培养方面的工作 1934 清华的李继侗和沈同发现银杏胚乳提 取物可刺激离体胚生长 1941 Van Overbeek 发现椰乳对幼胚发育 的促进作用 1943 罗士韦和王伏雄在Science发文章， 离体培养云南松和云南杉幼胚成功。胚乳培养的意义胚乳：三倍体胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类， 是研究这些产物代谢工程的理想系统完全由薄壁细胞组成的均质组织，是实验形 态发生学研究的极好材料。胚乳植株三倍体，高产、优质、果实无籽 1940 La Rue 最先培养胚乳 1970 Bhojwani 白花寄生获得胚乳植株 1977，1978 母锡金 王大元第一节 胚胎培养一、成熟胚培养盾片在胚吸收营养上有重要作用胚胎培养可以解除种皮抑制作用 MS适用于多种植物成熟胚培养成功例子：杂种桃成熟胚培养与新品种培育植物胚胎的发育时期二、幼胚培养幼胚在胚珠中异养，离体培养必须提供足够的营养和适宜 的条件。双子叶植物胚胎的发育时期：合子（zygote），二细胞原 胚（two-celled proembryo），球形胚（globular embryo ），心形胚（heart-shaped embryo），鱼雷形胚（ t