第六师农科所 王 航脱毒马铃薯组培室的基本情况组织培养：又叫离体培养,利用 细胞全能性，从植物体内分离 出符合需要的组织，经过培养 以获得再生的完整植株。为什么马铃薯要脱毒： 马铃薯块茎容易积累病毒，用 带病毒的块茎当种薯，产量逐 年下降，品质降低。容易染病 。一. 基本情况1 实验室设置及仪器设备 2 实验基本操作 3 培养基的成分及其配制1 实验室设置及仪器设备实验室是进行组培研究的主要场所，须满足洗涤、培养基制备、无菌操作、培养、鉴定等工作。1基本实验室1.1 洗涤间根据生产量的大小决定其大小，一般面积控 制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水 槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2 个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大 ，可以购置一台洗瓶机。地面应耐湿并排水良好 。面积60平方米左右，配备的主要仪器设备有 ：冰 箱、天平、微波炉、pH计、培养基灌装器、药品 柜、器械柜、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿 、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰 箱以体积200-250L为宜，用于储存培养基母液、 激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物 材料。1.2培养基配制间配备高压灭菌锅、灭菌锅的选择应根据不同的 要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小 型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用 立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验 室可选用大型的卧式灭菌锅。 小的10万，大的45万。1.3 灭菌室无菌操作室又叫接种室。通常由里外两间组成，外间 是缓冲间，用于准备工作，防止污染的作用。缓冲间 的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启 ，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲 间内应该设有洗手池、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无 菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员 进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种 接种器械等。 1.4 无菌操作室培养室应配有培养架、光照培养箱、自动控时器、臭氧 机等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板 的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度 为2000-3000lx。配备中央无菌过滤空调控温，消毒。1.5 培养室（一）、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。 如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 2 实验基本操作1、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微 米）紫外灯、超声波等。 2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒 精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、 双氧水、福尔马林等 （二）、灭菌的方法干热灭菌 玻璃器皿、器械 湿热灭菌 培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌 接种室、培养室过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水药剂灭菌 培养材料烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌 接种室。培养间各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方 法：150 、40min或120 、120min，如 果发现芽孢杆菌，160 、90120min（1）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水 、棉塞、纸等。121 维持2030min 注意点：加足水、排尽气、气压降到0时， 才能开盖（2）湿热灭菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培 养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂 GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血 清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度 ，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.220.45 微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至 50左右时，加入适量的激素，然后分装。（3）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室 空气、操作台等，灭菌时间2030min。 注意：关灯后5min后再进入。超净工作台 关灯后要打开风机。（4）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于 接种器皿的灭菌。（5）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等 。几种常用消毒剂的效果比较消 毒 剂使用浓度 (%)消毒时间 (min.)效 果残液去除 难易 乙醇750.1-3好易 新洁尔灭1020530好易 氯化汞0.11215最好最难 过氧化氢1012515较好最易 抗菌素450mgl-13060较好较难 次氯酸钙/纳9 10530好易（6）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲 醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算 ，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后 ，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗 或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也 倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶 液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一 部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的 甲醛挥发为气体。熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后 密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼 、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中 和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速 放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除 甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作 前2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸按需消毒空间每立方米用于苍术片(中药店 有售)1克计算，将苍术浸泡于95酒精内 ，酒精用量以淹没苍术为准，密封浸泡24 小时待用。消毒时将浸泡好的苍术置于1个 或2个耐高温容器内，点燃熏蒸2小时，每 周1次。需要注意的是，开始点燃时有5厘 米左右高的火焰，约持续2分钟。因此，需 待火焰灭后，观有淡淡的烟雾上升后室内 方可离人人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器 皿 和 用 具培养皿：洗热压 玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦湿布擦 泡75%95%酒精烧培养基：湿热培 养 材 料外部细菌：用水冲洗化学药剂处理 内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸污染来源三、无菌操作技术1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超 净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面 上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭 菌效果。 3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间 ，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。 进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下 工作台）4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验 用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械 在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金 属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧 ，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间 太长。5、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊 子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回， 灼烧瓶口，盖上瓶塞。注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必 太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用 手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或 取备品更换。 （3）为拿取方便，工作台面上的用品 要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在 右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工 作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处 理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用 前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立 即封闭瓶口直立可增加落菌机会。接种时时在近火焰处处打开瓶口，使瓶倾倾斜， 以免空气中微生物落入瓶中正 确 错错 误误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要 迅速正 确 错错 误误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带带来的污污染正 确 错错 误误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正 确 错错 误误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正 确 错错 误误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织组织 ：培养时时通常将其贴贴放在培养基表 面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正 确 错错 误误接种茎段：注意形态态学下端插入培养基内，而形 态态学上端露于空气中正 确 错错 误误3.培养基的成分及其配制一、培养基的成分及其作用（一）无机营养物质培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千 毫克。大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, S。 培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨 盐，或者两者结合的盐提供大量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所 需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl 其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注 意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等 毒害现象。微量元素（二）.有机化合物有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物 质和一些其它的有机添加物 1、维生素类物质维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可 能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸 吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称 维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛 酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12） 、叶酸（VBc），Vc等。2、AA类物质 绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用 的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也 用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖类 糖在培养基的作用： 1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）、维持渗透压 蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常 用的碳源。4、其它有机物质 1）肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质 另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂 ，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成 2）天然有机物 一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提 取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表 现出了良好的促进作用。n植物激素是在植物体内合成的，对植物 生长发育有显著调节作用的微量有机物 ，而植物生长调节剂是外源的调节植物 生长发育的物质。n无机元素和有机营养构成的培养基仅保 证培养物的生存与最低生理活动，只有 加入植物生长调节物质，才能诱导细胞 分裂、脱分化和再分化。（三）、植物生长调节物质1、生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA（吲哚丙酸） 2）萘酸类： NAA（萘乙酸） 3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T（ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-TP（ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。 其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最 强的生长素。生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 3、形成愈伤组织，促进生