一、蛋白质工程的概念工程化：理念设计设计 制造功能实现实现以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。蛋白质工程产生的标志1982年，Winter等首次报道了通过定点诱变获得改性的酪氨酸tRNA合成酶(Nature,299,1982)l1983年，Ulmer首先提出了“Protein Engineering”的概念（Science, 1983，219: 666-671） The prospects for protein engineering, including the roles of x-ray crystallography, chemical synthesis of DNA, and computer modelling of protein structure and folding , are discussed. -Deliberate design and production of proteins with novel or altered structure and properties, that are not found in natural proteins.三、蛋白质工程的研究内容以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白新的蛋白质质，以满足人类对生产和生活的需求。1. 蛋白质结构分析第一个AA的 -C=O 和第四个AA的 N-H 之间间形成氢键氢键一个不很稳稳定的环环状结结构。3.2转角(-turn)n由3个AA构成的转角四、维系蛋白质结构的作用力肽键 二硫键氢键离子键金属离子配位键 疏水键 范德华力第二遗传密码现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的信息传递， 因此是不完整的。无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关 系，称之为第二遗传密码或折叠密码3.第二遗传密码的特点简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。全局性和复杂性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用， 并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经 形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响等。一、蛋白质和新生肽链折叠新生肽链的折叠不仅指肽链在空间的盘旋卷曲，而是包括广义的新生肽链的整 个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、亚基组装、水解激活 等。蛋白质的折叠(protein folding)从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨 基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。3.体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行不同。细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。温度、浓度、pH值不同细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问题。三、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子分子伴侣 （molecular chaperone）折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI)molecular chaperoneA large and diverse group of unrelated proteins that all share the functional property of assisting the noncovalent assembly and/or disassembly of protein containing structures in vivo, but are not permanent components of these structures when they are performing their normal biological functions.一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。分子伴侣的定义完全是功能上的。分子伴侣与酶的异同点相同点参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现不同点分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性分子伴侣的催化效率很低分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。1.2分子伴侣与酶的异同点1.3分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合。由分子伴侣和靠消耗三磷酸腺苷的能量而发挥作用的特定的蛋白水解酶组成。 分子伴侣帮助新生肽正确折叠；而特定的蛋白水解酶把不能继续正确折叠的或错误折叠的“垃圾”水解成小分子。 分诊治疗机制（triage） 如何“诊断”和区分什么样的新生肽“病人”可以送到分子伴侣“病房”进行治疗和拯救，而什么样的新生肽“病人”已“无可救药”，只能送给蛋白水解酶去处理。细胞内新生肽“病人”的命运主要是由分子伴侣处理“病人”的能力和速度在动力学上来决定的。 1.熵判据和蛋白质折叠未折叠的状态包含很多具有不同构 象的分子。2.吉布斯自由能判据和蛋白质折叠G= H- TS1.The Levinthal Paradox当蛋白折叠是构象搜索时，将会有太多的构象需要尝试。 仅仅考虑蛋白的主链，每个残基在未折叠时假设只有3个构象 ，对一个有100AA的多肽来说将有 3100 构象。如果构象搜索的速度是 1012 构象/s，需要5 x 1035 s (1.6 x 1028 y)蛋白质折叠不是随机的，而是有捷径的。常见“折叠病”老年性痴呆症(Alzheimer syndrome)病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白质簇。主要分为 两类：含有沉淀样蛋白（A ）的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经 细胞内自损伤。帕金森氏症（Parkinson disease）主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制能力逐渐丧失 ，因为能产生多巴胺的神经细胞逐步被破坏，其原因和发生机制尚 不清楚。某些肿瘤抑癌基因突变造成抑癌基因编码的蛋白质稳定性改变引起的一些癌 症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。2设计层次分类基于天然蛋白质结构的分子设计“小改”：定位突变和化学修饰“中改”：结构域进行拼接组装全新蛋白质设计（“大改”）完全从头设计全新的蛋白质Knowledge-based approachcycle1甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸分子量都比较小灵活性 GlyAlaPro甘氨酸具有高度柔韧性，可在螺旋、 折叠处出现，但更 常见于铰链区或 转角。Gly在定点突变时，一般不宜随意 改变Pro比较刚性，常出现在转角Ala处于二者之间，常用作取代别的氨基酸的首选。Pro和Gly是螺旋的中断者MethodsSpecificOld specificuDNA shuffling uCassette mutugenesisNew specificuOligo-directed site mutagenesisuPCR based site mutagenesisUnspecificOld unspecificuUVuX-rayuOther chemicalNew unspecificutransposonsudegenerated primerstransposons转座子:细胞中能改变自身位置的一段 DNA会跳舞的基因从染色体的一个位置跳到另一位置，从一个染色体跳到另一染色体。 Oligo-directed site mutagenesis ssDNA (M13 method) and dsDNA Kunkel method DpnI method Antibiotic resistance RE-site 2.Crossover PCR重叠延伸PCR的原理为采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重 叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩 增片段重叠拼接起来。该方法首先在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为 上下游引物，且分别与模板链互补，引物C、D为突变引物。先以引物 B、C进行PCR，得产物BC，再以引物A、D进行PCR得AD，混合扩 增产物，以A、B为引物进行扩增，可得到具有突变位点的DNA片段。 Gene fusion and gene linkMethods of Gene fusion and gene linkVia REVia silent mutation creat unique REVia crossover PCRVia inteintRNA-mediated protein engineeringIncorporation of non-natural amino acids into proteins蛋白质化学修饰的意义改变蛋白质的药代动力学调解蛋白质的稳定性以及活性改变蛋白质的空间构象荧光标记靶点成像与临床检测概念凡是通过化学基团或离子的引入或除去，而使蛋白 质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修 饰侧链基团的改变化学修饰的范畴主链结构的改变分子生物学基因重组和定点突变体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH试剂试剂 特点：具有氧化性或还还原性。氧化剂剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚酰亚 胺可被氧化的侧链侧链 基团团：巯巯基，甲硫基，吲哚吲哚 基（Trp）、咪唑唑基、酚基等。还还原剂剂：2巯巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。可被还还原的侧链侧链 基团团：二硫键键。3)氧化/还原反应1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、 动物细胞等。 由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核 （细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表 达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。 通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅 助成分。 比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。蛋白质的表达系统40关于表达载体的一些分子生物学概念n启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。n-10区（pribnow box）和 -35区组成n分类n转录形式n组成型n诱导型n强弱n取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序 列。 41T7 噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启动子的转录。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5倍左右。并可以转