第五章 种子扩大培养l掌握工业发酵种子扩大培养的工艺过 程及操作要点 l理解影响种子质量的因素学习目标种子扩大培养概念：种子扩大培养概念：v种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量 的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 种子扩大培养的原因工业生产规模的增大 需要种子就增多 种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养 物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量 足够的培养物。菌种扩大培养菌种扩大培养（1）为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。（2）发酵时间的长短与接种量的大小有关，接种量大， 发酵时间则短。 （3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩 短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少 染菌的机会。 （4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长 繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。种子液(几或几十立方米)按按10%10%接种量接种量发酵罐(几十或几百立方米)由实验室制备到车间生产的过程作为种子的要求：1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短2)、生理性状稳定3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4)、无杂菌污染5)、保持稳定的生产能力第一节 种子制备工艺u固体培养法u液体培养法(两类）v操作步骤v培养设备v优缺点1、固体培养法v培养类型2、液体培养法静置培养通气培养厌氧发酵罐摇瓶或种子罐通气量充足，溶氧好，菌体生长快 ，适合菌丝的种子制备v种子制备的过程大致可分为： 实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 一、 实验室种子制备保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面上的菌种经 无菌操作接入适合于孢子发芽或者营养体生长的斜 面培养基上，经培养成熟后挑选正常的孢子或营养 菌体再一次接入试管斜面反复培养几代。这一阶段也称为活化，目的是使保藏的菌种达 到正常稳定的生长代谢速度。斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特 性的不同可采用不同的培养方法。可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，要注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散 。接入孢子，25-28培养14d。培养结束，将孢子瓶于真 空下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存备用。产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的 菌种生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。通过实验室种子扩培获得一定数量和质量的菌体。 斜面菌种于32，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32培养12h，即可作种子罐种子。例如：谷氨酸棒状杆菌。不产孢子的菌种一般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4冰箱保存.每年移种3-4次。斜面菌种接入含10mL麦芽汁试管25-27培养2-3d扩大至三角瓶25培养2d移至含5-10L麦芽汁的罐15-20培养3-5d含100L麦芽汁的发酵罐。生产啤酒的酵母菌MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g 蛋白胨, 10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。除蛋白质、盐类、维 生素外能溶于水的浸 出物质，包括含氮浸 出物和无氮浸出物。二、生产车间种子制备二、生产车间种子制备采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。种子罐培养原则：以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做种 子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对种 子的要求。摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种：接种方法：可在火焰保护下接入种子 罐或采用压差法接入。主要采用压差法，由种子接种 管道进行移种，移种过程中要 防止接受罐表压降至零.种子罐级数的确定种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.种子罐的作种子罐的作 用？用？种子制备的工艺过程中，因菌种不同，一 般可以分为一级种子、二级种子和三级种子 。种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌 体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设 备的合理利用率。一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵 。依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1v种子罐级数的意义：种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。一、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵1、斜面培养培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5琼脂 2%， pH 7.07.2。培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32，生长1824h。生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传 代不超过3次。2. 一级种子（摇瓶）培养条件：于1000mL三角瓶中，装液200 250mL，32培养12h。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5K2HPO4 0.1%。培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原 料已经基本接近于发酵培养基。培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养710h。培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%。培养基的特点：菌体生长，更接近于发酵培养基。3、二级种子（种子罐）v108109cfu/mL。（菌数） v大小均匀，呈单个或八字排列。（菌体） vpH 7.07.2时结束。（性能） v活力旺盛。（活力）种子的质量要求：二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程：安瓿管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等。培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。培养条件：25、7d，注意湿度50%左右。1、斜面孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）。培养基的特点：成本低、米粒之间结构 疏松提高比表面积和氧的传质 ，营养适当（要求大米的白点 小）有利于孢子的生长。培养条件：25、7d，控制湿度。大米孢子的要求：1粒米含1.4106个孢子。2、大米孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆。目的：菌体生长。培养条件：27，40h。 接种量：200亿孢子/t。4、二级种子培养基：同上培养条件：27、1014h。接种量：10%。种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小 空孢，处于期。青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期， 14为年青期，46期合成青霉素的能 力最强。v种子制备方法 v实验室种子制备工艺 v生产车间种子制备工艺复习上一课内容v种子质量标准 v种子质量判断方法 v影响孢子质量的因素 v影响种子质量的因素第三节 影响种子质量的因素v培养基 v培养条件 v种龄 v接种量影响种子质量的因素v生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其 主要原因是原材料质量波动。v营养成分适合种子培养的需要v营养成分要尽可能与发酵培养基相近1.培养基v温度v溶解氧一般前期需氧量少，后期需氧量较多。v逐级的接近发酵培养的条件2.培养条件v种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级 种子罐或发酵罐时的培养时间。v通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期， 菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。 时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体 自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。v不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一 样的，一般需经过多种实验来确定。3.种龄v接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液 体积的比例。v通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌 715%，有时2025%4、接种量v接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁 殖的速度。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖 达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可 减少杂菌的生长机会。过大会引起溶氧不足，影 响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经 济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率 。A 菌种稳定性的检查生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保藏在休眠状态的环境中，但微生物或多或 少会出现变异的危险，因此定期考察及挑选稳定 菌种十分重要。方法：取少许菌种，逐级稀释，划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落，摇瓶试验，测 定生产能力。种子质量的控制B 无(杂)菌检查种子制备过程中，每移种一步，均需进行杂菌检查。方法：镜检、肉汤或平板培养、种子液生化分析。生化分析项目：营养消耗的速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。