Real-Time PCR原理、应用及数据分析原理及应用引物设计数据分析需要注意的问题4123原 理 Real-Time PCR 是指在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。荧光基团？SYBR Green I TaqMan probe实时检测？Threshold：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检 出界限。CT value： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环 数。定量？定量？通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。Real-Time PCR vs. 常规 PCR 常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的缺点检测终产物,对起始模板定量不准确EB的敏感性低Real-Time PCRPCR分析分析方法的优点对起始模板定量准确SYBR的敏感性高应 用 基因表达差异分析神经病理性痛模型中IL受体基因在脊髓背角的变化 DNA 或RNA 的绝对定量分析病原微生物或病毒含量的检测转基因拷贝数的检测RNAi 基因失活率的检测等引物设计NCBI查找需要的目的基因的序列Takara公司 金斯瑞公司一般需要1周标准品的制备RNA样品定量标准品Total RNA & cDNA体外转录体外转录RNAPCR产物或质粒 标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常10理想的标准品扩增曲线基线平整基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽数据分析 绝对定量试验最终结果要求精确到拷贝数水平试验最终结果要求精 确到拷贝数水平标准曲线法 相对定量比较CT值法假设目的基因与管家基因扩增效率相同且等于100%时即实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数CT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组对照组实验组= 2-CTCT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组绝对定量v.s.相对定量 绝对定量 优点：给出的是目标基因的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品；标准品必须准确测定，难以制备和质 控相对定量 优点：可以不做标准品；使用广泛 缺点：数据理解困难CT需要注意的问题 防止Genomic DNA污染Total RNA 用DNase I消化。 样品进行均一化目的基因和管家基因一起扩增。 检验扩增产物的特异性特异性产物非特异扩增引物二聚体分析目的基因的融解曲线 保证扩增效率的一致 扩增产物长度：75-200bp 管家和目标基因地扩增长度要接近 引物设计特异，退火温度一致 模板纯度、复杂度等 反应条件优化 一个样本同次扩增要做3个复孔，取平均值。 同一种处理的模型样本，要做多个重复。 操作要确保精确，选用Gilson的移液器。 防止污染。www.themegallery.comThank You!