1银杏叶多糖提取、纯化及其含量的测定【摘要 】 目的研究银杏叶多糖的提取纯化及含量测定。方法通过对不同的提取次数、固液比及提取时间等实验，以及对粗多糖纯化的研究，确立各因素条件，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。结果各因素条件为浸提温度 80，提取时间 3 h，固液比 130，提取2 次，用活性炭纯化。由此得银杏叶中粗多糖的得率为 12.2%，纯化后的多糖得率为 9.8%。测定提取的粗多糖中多糖含量为35.7%，纯化后的多糖含量为 43.3%，多糖含量测定相对标准偏差小于 3.0%。结论该方法纯化效果好，测定重现性好，得出银杏叶中多糖含量为 4.3%。 【关键词】 银杏叶 多糖 提取 纯化 多糖测定Abstract:ObjectiveThe extraction and purification methods for polysaccharide in Gingko leaves were studied and the content of polysaccharide in it was determined.MethodsThe condition of each factor for extraction and pruification from the leaves of Gingko was established through the experiments of extraction times, different ratios of material to extraction solvent and 2extraction time.The method of phenol-sulfuric acid was applied to determination of the content of the polysaccharide.ResultsThe conditions of the factors were extraction temperature 80，extraction time 3h,material to extraction solvent 1:30 ,extraction 2 times and activated carbon for purification.Raw polysaccharide in gingko leaves was 12.2%,the polysaccharide after prurified was 9.8%, the content of polysaccharide in the raw polysaccharide was 35.67%,and in the pure one was 43.32%,ConclusionThe purification method is efficient and stable. The content of polysaccharide in gingko leaves is 4.3%.Key words:Ginkgo leaves； Polysaccharide； Extraction； Purification； Determination of polysaccharide多糖又称多聚糖（polysaccharide） ，是构成生命活动的四大基本物质之一，不仅是机体主要供能物质，同时还具有多种多样的生物学功能，在生命活动中参与了细胞的各种活动。目前人们所知活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效15 ，其作用日益受到人们的重视。3银杏 (Ginkgo) 是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，素有“活化石”之称。中国是银杏的发源地，其资源占世界总量的 70%左右6，7 。目前，银杏叶制剂已从单纯的药用逐步应用到食品饮料、保健品等行业，含银杏叶提取物的护发、生发、护肤等化妆品的开发也取得一定的进展。银杏叶内含有具有重要生理和药理活性作用的功能活性成分，但关于银杏叶中多糖的研究目前报道甚少，原因在于人们把精力都集中在了银杏叶中黄酮类物质的研究上712 ，而忽略了多糖。本实验对银杏叶中多糖提取的影响因素、纯化进行了一系列的研究，确定了提取纯化条件。同时对提取、纯化的多糖含量进行了测定，确定了银杏叶中多糖含量。这对于银杏叶的综合开发利用具有重要意义。1 材料与方法1.1 仪器与试剂恒温水浴，离心机，恒温干燥箱，真空干燥箱，紫外-可见分光光度计。95%乙醇，无水乙醇，三氯甲烷均为分析纯；葡萄糖为生化试剂。1.2 试样来源及预处理所用银杏叶样品，于 200511 采自大连民族学院校园内。将采得的银杏叶用自来水洗净，然后用蒸馏4水清洗，淋干水后，用 70恒温干燥箱烘干。1.3 提取、纯化方法银杏叶多糖提取、纯化步骤如下：a)银杏叶处理：实验前用 70 恒温干燥箱将银杏叶再烘 1 次，然后用高速粉碎机粉碎，过 80 目筛，置于棕色瓶中保存。b) 恒温提取：按一定固液比加水，在恒温水浴中恒温提取。c) 离心：提取后用离心机以 5 000 r/min 离心 20 min，收集上清液，残渣同前再提取 1 次，合并两次上清液。d) 纯化：离心后得到的上清液，用活性炭纯化。e) 浓缩：用真空干燥箱对纯化后的离心液进行浓缩。f) 醇沉淀：加入 5 倍体积的 95%乙醇，放入冰箱内静置 24 h。g) 离心：对醇沉的白色絮状多糖沉淀进行离心。h) 洗涤：得到的多糖用无水乙醇和三氯甲烷依次清洗后放入小烧杯中，在水浴锅中蒸干后，放入 80烘箱中干燥。52 结果与结论2.1 多糖提取影响因子实验2.1.1 固液比对粗多糖得率的影响取 5 份 5 g 银杏叶样品分别放置于 250 ml 具塞三角瓶中，按固液比110，120，130，140，150 分别加入50，100，150，200，250 ml 的蒸馏水， pH 7，在 80 水浴中提取 3 h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置 24 h 后再离心，粗多糖得率见图 1。由图 1 可见，固液比越大越好，但要进行 2 次提取，因此，固液比不要太大。由图 1 可以看出，固液比达到 130 以后，粗多糖得率增加缓慢。固液比为 130 时，粗多糖得率为 10.4%，固液比为 140 时粗多糖得率为 10.5%，仅增加 0.1%；固液比为 145时，粗多糖得率为 10.7%，比固液比为 140 增加 0.2%，比固液比为 130 增加 0.3%。而固液比为 120 时，粗多糖得率为9.4%，固液比为 130，比 120 粗多糖得率增加 1.0%。所以选用固液比 130。2.1.2 提取时间对粗多糖得率的影响取 6 份 5 g 银杏叶样品6分别放置于 250 ml 具塞三角瓶中，按固液比 130 加入蒸馏水150 ml， pH 7，在 80水浴中分别提取 0.5，1 ，2，3，4，5 h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置 24 h 后再离心，粗多糖得率见图 2。由图 2 可见，蒸馏水浸提 3 h 后再延长浸提时间，对提取率的提高没有显著影响。当提取时间为 3 h 时，粗多糖得率为 9.3%，提取时间为 4 h 时，粗多糖得率为 9.6%，得率仅提高 0.3%；当提取时间为 5 h 时，粗多糖得率为 9.8%，得率比 4 h 提高 0.2%，比 3 h 提高 0.5%。而提取时间为 3 h 比 2 h 得率提高 2.1%，所以，提取时间应以 3 h 为佳。2.1.3 提取次数对粗多糖得率的影响取 1 份 5 g 银杏叶粉末放于 250 ml 具塞三角瓶中，按固液比 130 加入蒸馏水，pH 7，在 80水浴中提取 3 h，离心。收集提取离心后的残渣，按上述条件再提取 2 次。3 次提取所得的提取液分别放置于 3 个三角瓶中，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置 24 h 后离心，粗多糖得率见图3。由图 3 可见，第 1 次提取粗多糖的得率最高，为 9.0%；第 2 次次之，为 2.8%；第 3 次仅有 0.4%，所以本实验提取次数选为 2 次。72.1.4 温度对粗多糖得率的影响取 5 份 5 g 银杏叶样品分别放于250 ml 具塞三角瓶中，按固液比 130 加入 pH 7 的蒸馏水，分别在 70，75，80 ，85，90 水浴中提取 3h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置 24 h 后再离心，粗多糖得率见图 4。由图 4 可见，随着提取温度的升高，多糖得率逐渐增大，在80达到最高，多糖得率为 9.2%。但当达到 85 以后，粗多糖得率却缓慢下降。85时得率为 9.0%，比 80降低 0.2%；90时得率为 7.6%，比 85 降低 1.4%，比 80 时降低 1.6%。这是由于温度过高，多糖发生了降解，说明此时条件不利于多糖的提取，故本实验采用 80为最佳提取温度。按上述条件提取得到的银杏叶中粗多糖得率为 12.2%，呈棕黄色。2.2 银杏叶多糖的纯化研究对得到的银杏叶粗多糖提取物的精制，首先要考虑的是除去与多糖共沉淀的杂质，如黄酮等物质。由于银杏叶中含有大量的黄酮类化合物，在提取粗多糖的过程中不可避免地会与多糖发生共沉淀。黄酮溶于乙醇，所以首先考虑用乙醇来精制，同时也采用了活性炭精制的方法。2.2.1 未精制的粗多糖取 0.100 g 提取的干燥粗多糖，用蒸馏水溶解后转移于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。8用紫外分光光度计在 190320 nm 范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图 5。由图 5 看出，在粗多糖提取液未经任何处理时，提取的粗多糖吸光度高达 5.0。2.2.2 乙醇精制方法一在提取的粗多糖用乙醇沉淀 24 h 后，离心前用 50 ml 无水乙醇洗涤，然后离心。取上述方法得到的干燥粗多糖 0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在 190320 nm 范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图 6。由图 6 可以看出，粗多糖经乙醇洗涤后，有部分杂质被去除，所以谱图 6 与谱图 5 对比在 320nm 附近的吸光度略有下降。2.2.3 乙醇精制方法二将提取的粗多糖在离心后，干燥前用50 ml 无水乙醇分两次洗涤，离心。取上述方法得到的干燥粗多糖0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在 190320 nm 范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图 7。由图 7 可看出采用这种乙醇洗涤的方法比乙醇精制方法一效果9要好一些，在 255320 nm 波长范围内，吸光度有明显下降，说明这种方法要优于乙醇精制方法一。2.2.4 乙醇精制方法三将提取的粗多糖在离心、干燥后用 60 ml 蒸馏水溶解，再用乙醇沉淀，离心，干燥。取上述方法得到的多糖 0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在 190320 nm 范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图 8。由图 8 可以看出采用这种方法比前两种方法效果要好一些，在230 320 nm 波长范围内，吸光度明显下降，说明这种方法要优于乙醇精制方法二，但纯化效果不是很理想。2.2.5 活性炭精制取 5.0 g 已粉碎的银杏叶按已确立的最佳提取条件在 80水浴中提取 2 次，得到的提取液用活性炭精制，然后将滤液浓缩，加乙醇沉淀，得到多糖。称取提取的多糖 0.1 g，用蒸馏水溶解后转移于 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在 190320 nm 范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图 9。由图 9 可以看出采用活性炭吸附的方法比用乙醇去黄酮的方法效果要好得多。在 190320