高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法陈 严 姜 明 汤 敏谦宝生物工程（大连）有限公司,116600目的：目的：1. 1.在目的基因中的特定位点导入突变，包括：在目的基因中的特定位点导入突变，包括： 碱基缺失 碱基置换 碱基插入2. 通过突变基因的表达，可以为蛋白质结通过突变基因的表达，可以为蛋白质结构及功能的分析和改造提供有效途径构及功能的分析和改造提供有效途径。TaKaRaTaKaRa用于定点突变的试剂盒用于定点突变的试剂盒 MutanMutan-Express Km Kit-Express Km Kit MutanMutan-Super Express Km Kit-Super Express Km Kit MutanMutan-K Kit-K Kit TaKaRa TaKaRa MutanBESTMutanBEST Kit KitMutanMutan-Express Km-Express Km原理：原理：ODAODA法法E.coli BMH71-18 mutS、MV1184 Competent Cell or Electro Cell导入变异Primer材料与方法材料与方法MaterialsMaterialsProtocolProtocolReaction MixtureAnnealing/ExtensionDNA SampleTransformation（1）E.coli BMH71-18 mutSPlasmid MiniprepDNATransformation（2） MV1184ColonySequencingMutanMutan-Super Express Km-Super Express Km原原 理：理：ODA-LA PCRODA-LA PCR法法E.coli MV1184 Competent Cell or Electro CellpKF18k/pKF19k DNA导入变异用寡聚核苷酸（5-P）材料与方法材料与方法MaterialsMaterialsReaction MixturePCR反应DNA精制Transformation sup0 菌株（MV1184）SequencingColonyProtocolProtocolMutanMutan-K-K原理：原理：KunkelKunkel法法材料与方法材料与方法E.coli BMH71-18 mutS 、 CJ236 、MV1184 Competent Cell or Electro Cell导入变异用寡聚核苷酸M13 mp18 RF or M13 mp19 RF or pUC118/119MaterialsMaterialsProtocolProtocolCloned DNA（M13）Transfection CJ236ssDNA Sample变异用寡聚核苷酸5磷酸化Annealing ExtensionDNA Sample Transfection BMH71-18 mutSPhageTransfection MV1184（ung+ Cell）噬菌斑TaKaRaTaKaRa MutanBEST MutanBEST原理：原理：PCRPCR法法 材料与方法材料与方法导入变异用PrimerE.coli JM109 Competent cellMaterialsMaterialsProtocolProtocolReaction MixturePCR反应电泳回收PCR FragmentBKL反应DNA SampleTransformation（JM109 ）SequencingColonyTaKaRa TaKaRa MutanBEST MutanBEST KitKit使用实例使用实例5 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG 33 CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGAC 5 pUC118引入点变异区域碱基序列GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCPrimer 1Primer 2Step I . PCRStep I . PCR反应反应10Pyrobest BufferdNTP Mixtrue（各2.5 mM）Primer 1Primer 2TemplatePyrobest DNA Polymerase (5 U/ml)灭菌蒸馏水 up to5 l4 l0.21.0 M(final conc.)0.21.0 M(final conc.)1 g0.25 l50 l94 30 sec 55 30 sec 72 5min30 CyclesPCR Fragment10Blunting Kination BufferBlunting Kination Enzyme Mix.ddH2O up to2 l1 l20 l 0.2-20 pmolStep Step . Blunting . Blunting KinationKination Reaction Reaction37，10min.Step Step . . Ligation Ligation Reaction ReactionDNA Fragment 5l Ligation Solution I 5l 16,1hr Transformation JM109 ColonySequencing结果结果：1. TransformationTransformation2. SequencingSequencing挑取10个蓝色菌落进行测序，证明完全回复pUC118 正常碱基序列，且在其它位置未发现有变异出现。TaKaRa Site-Directed TaKaRa Site-Directed Mutagenesis Mutagenesis SystemSystem比较比较谢谢大家！谢谢大家！