1银杏酸平衡溶解度和表观油水分配系数的测定作者：杨小明，梁健 王驰芳，高倩【摘要 】 目的测定银杏酸在水、缓冲溶液、有机溶剂中的平衡溶解度，及在正辛醇-水和正辛醇- 缓冲液体系中的表观油水分配系数。方法采用高效液相法测定银杏酸的浓度，采用摇瓶法测定银杏酸的表观油水分配系数。结果 25 银杏酸在水中的平衡溶解度为 0.886 8 mgL-1;在酸性缓冲溶液中的平衡溶解度较水中略有增加;在碱性缓冲溶液中的平衡溶解度随 pH 上升增加显著。银杏酸在甲醇、乙醇、正丁醇和正辛醇中平衡溶解度均大于 35 gL-1。37 银杏酸的正辛醇-水表观油水分配系数为 14.2 (lg Papp = 1.15);在正辛醇-pH 2.0 磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数较大307.2(lg Papp =2.49)。结论银杏酸的脂溶性好，水溶性差，增大 pH 值可增加银杏酸的水溶性。 【关键词】 银杏酸;平衡溶解度;表观油水分配系数;高效液相色谱法银杏酸(Ginkgolic acid)是从银杏 Ginkgo biloba L.中分离得到的酚酸类化合物，为 6-烷(烯) 基水杨酸的衍生物，其苯环 6 位碳链长度 13-17，双键数 0-2，其结构见图 1。银杏酸具有广泛的生物2活性，如抗肿瘤、抑菌、杀钉螺等14，其抑制肿瘤细胞的生长机理为诱导肿瘤细胞的凋亡4，5。寻找肿瘤细胞凋亡诱导剂是开发新型抗肿瘤药物的途径之一，许多抗肿瘤药物的作用机制就是基于诱导肿瘤细胞凋亡6，因此银杏酸被认为是一具有良好前景的抗肿瘤药物，有必要进行新药的制剂研究。本课题组前期已建立了小鼠血浆中银杏酸浓度的高效液相测定方法7，但目前尚未见有银杏酸平衡溶解度及油水分配系数等理化性质的报道，而药物的物理化学参数与其在生物体内膜渗透性具有相关性，有助于预测药物动力学性质8。本文中作者对银杏酸的平衡溶解度、表观油水分配系数等理化参数进行测定，为银杏酸吸收代谢研究、新剂型的开发以及其他药学研究提供参考。图 1 银杏酸结构式1 仪器与试剂美国 VARIAN 公司 ProStar 高效液相色谱仪： Prostar 210双泵，Prostar 325 UV 检测器，手动进样器，20 l 定量环;Star WS V6.3 化学工作站;DF-101S 恒温加热磁力搅拌器( 巩义市予华仪器有限责任公司);超级恒温槽 ;THZ-82 水浴恒温振荡器 (江苏金坛市中大仪器厂);H-1650 高速离心机( 长沙湘仪离心机仪器有限公司 );PHS-2C 酸度计(上海理达仪器厂) 。银杏酸样品由本实验室自制，总银杏酸含量98% ，银杏酸的组成和含量为 C13:0, 20.7%; C15:0, 3.3%; C15:1, 51.6%;C17:1, 21.1% and C17:2, 3.3%。甲醇3(色谱纯，由上海医药集团提供);其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱： SinoChrom ODS-AP C18(250 mm 4.6 mm，5 m);流动相：甲醇-3%HAc(928); 流速 1 ml min-1;检测波长 310 nm;柱温 40。在上述色谱条件下，银杏酸的 5 个单体实现了基线的完全分离。结果见图 2。图 2 银杏酸的 HPLC 图2.2 银杏酸标准曲线的建立准确称取 25 mg 银杏酸，置于25 ml 容量瓶中，加入适量以甲醇溶解后，加甲醇至刻度，摇匀得质量浓度为 1 mgml-1 的储备液。精密量取一定量储备液于 10 ml容量瓶中，加甲醇配成 25，50，100，150，200 mgL-1 的系列标准溶液，分别进样 20 l，记录峰面积，以银杏酸峰面积之和 A为纵坐标，银杏酸浓度 C(mgL-1)为横坐标进行线性回归，得银杏酸的线性回归方程为：A=9.314C+323.7，r=0.999 5，结果表明银杏酸在 25200 mgL-1 内浓度与峰面积之和呈良好的线性关系。另量取一定量的 100 mgL-1 银杏酸溶液于 10 ml 容量瓶中，加甲醇配成 0.25，1，5，10，15，20，25 mgL-1 的系列标准溶液，同法得银杏酸的线性回归方程为：A=11.52C+8.641，r=0.999 6，结果表明银杏酸在 0.2525 mgL-1 内也呈良好的线性关系。42.3 精密度实验取质量浓度分别为 100，15 mgL-1 的银杏酸溶液按“2.1”项条色谱条件连续进样 6 次，计算相对标准偏差(RSD)，结果 RSD 分别为 1.93%和 1.27%，均小于 2 %，表明该方法的精密度良好。2.4 平衡溶解度的测定将过量的银杏酸置于 10 ml 具塞玻璃试管中，分别加入适量水、pH 2.0，3.0，4.0，6.0，7.0 ，8.0 ，9.0，10.0，11.0 的磷酸盐缓冲溶液，以及甲醇、乙醇、正丁醇和正辛醇，于恒温水浴中搅拌至银杏酸浓度稳定，恒温静置 24 h 后离心、过滤，进样 20 l;超出线性范围的样品用适当甲醇稀释后进样，记录峰面积。按外标法以 5 个峰面积之和计算银杏酸在各介质中的平衡溶解度。银杏酸在 25，37水中的平衡溶解度分别为 0.886 8 mgL-1 和 1.397 mg L-1。在 25 不同 pH 磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度见图 3。银杏酸在水、酸性磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)中的平衡溶解度较低;而在碱性磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度随 pH 上升明显增大，在 pH 10.0 和pH 11.0 的缓冲液中银杏酸的平衡溶解度分别达到 52.36 mgL-1和 81.21 mgL-1。银杏酸在各种常见有机溶剂中的平衡溶解度分别为：甲醇 35.33 gL-1;乙醇 39.07 gL-1;正丁醇 123.5 gL-1;正辛醇136.2 gL-1，溶解度随着溶剂碳链长度的增加而增加。图 3 银杏酸在 25 条件下不同 pH 溶液中的平衡溶解度52.5 表观油水分配系数的测定取银杏酸适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为 100 mgml-1 的正辛醇溶液。取该溶液 1 ml 置于具塞试管中，分别加入正辛醇饱和的水、pH 2.0，3.0，4.0，5.0，5.2 ，6.0 ，7.0，8.0，9.0 ，10.0，11.0 的磷酸盐缓冲液，(371)水浴恒温振荡器中振荡直至平衡，以 3 000 rmin-1 离心 10 min，取下层水相过滤，进样 20 l，记录峰面积，代入标准曲线计算水相银杏酸的浓度 w;另取 100 l 正辛醇相于10 ml 的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，将该溶液用甲醇再稀释100 倍后过滤，进样 20 l，记录峰面积，代入标准曲线计算油相银杏酸的浓度 o。按公式 Papp=o/w 计算表观油水分配系数。银杏酸溶于 37正辛醇饱和的水中，测得其 pH 值为 5.2，正辛醇- 水表观分配系数 Papp 为 14.2 (lg Papp =1.15)。银杏酸在强酸性缓冲液中的表观油水分配系数较大(pH 2.0，lg Papp =2.49)，但随pH 增加 lg Papp 逐渐降低，在 pH 8.0 出现最小值(lg Papp=0.81);pH 9.0 后略有上升(lg Papp =1.20)，直至 pH 11.0，其表观油水分配系数再无明显改变。银杏酸在不同 pH 缓冲溶液中表观分配系数见图 4。图 4 银杏酸在 37 条件下不同 pH 缓冲溶液中的表观分配系数3 讨论银杏酸是采用弱极性溶剂从银杏中分离得到的脂溶性化合物，6在 4 呈半固态膏状，温度高于 50 时为油状液体。在预实验中发现银杏酸在强碱性条件下会产生降解，而强酸性条件对其影响较小，因此将试验的 pH 范围选在 pH 2.011.0。银杏酸在水溶液中48 h 达到溶解平衡，在 37 恒温 3 d 银杏酸浓度没有显著变化，因此在试验中，银杏酸搅拌/振荡溶解 48 h，达到溶解平衡后，恒温静置 24 h 再进行测定。实验结果表明，银杏酸在水中的溶解性很差(25 在水中的平衡溶解度为 0.886 8 mgL-1)，在酸性磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度较水中略有增大(在 pH 2.0 磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度为 2.005 mgL-1)，可能是由于加入的磷酸盐具有助溶作用。在碱性条件下，银杏酸的平衡溶解度随着 pH 的升高而显著增大，在 pH 8.0 时出现浑浊，易形成胶体，增加了银杏酸在缓冲溶液中的分散量;pH 值继续增加，银杏酸形成盐溶液，故溶解度急剧上升。银杏酸在有机溶剂中的溶解度明显增大，在甲醇中的平衡溶解度为 35.33 gL-1，并随着有机溶剂极性的降低而溶解度加大。测定银杏酸在不同溶剂中的溶解性，可为银杏酸的提取、纯化、生物样品的预处理提供参考。不同 pH 对银杏酸的油水分配系数有着显著的影响。pH 2.0时，lg Papp =2.49;随着 pH 上升，lg Papp 逐渐下降，pH 6.0 8.0 时，lg Papp 为 0.930.81，均小于 1.0;pH 9.011.0 时，lg 7Papp 维持在 1.20 左右。有研究表明，lg Papp 较小的化合物吸收差，lg Papp1.0 的化合物吸收较好。可见银杏酸在强酸性的环境中会有较好的吸收，而在 pH 6.08.0 范围内吸收差。银杏酸的正辛醇-水分配系数 Papp 为 14.2(lg Papp =1.15)，表明其疏水性强不是限制其口服吸收的主要因素。药物必须具有一定的水溶性及脂溶性，使其能透过生物膜而被吸收。正辛醇-缓冲溶液分配系数和正辛醇-水分配系数在预测药物定量结构-吸收上具有重要意义9 ，10。对银杏酸表观油水分配系数的测定，不仅可为银杏酸新剂型的工艺提供基础数据，还为银杏酸的构效关系、吸收代谢研究提供参考。【参考文献】1杨小明，朱伟,陈钧，等. 银杏酸单体的抗菌活性研究J.中药材,2004, 27(9): 661.2杨小明，陈盛霞，张蓉仙，等. 银杏外种皮石油醚提取物的杀钉螺活性研究J . 中国人兽共患病学报，2006，22(10):961.3杨小明，钱之玉，陈钧，等.银杏外种皮中银杏酸的体外抗肿瘤活性研究J. 中药材， 2004，27(1):40.84Liu ZH, Zeng S. Cytotoxicity of ginkgolic acid in HepG2 cells and primsry rat hepatocytesJ. Toxicology Letters，2009, 187:131.5杨小明，陈永昌，陈钧，等. 银杏中银杏酸诱导人白血病细胞 U937 凋亡的研究J, 食品科学,2006，27(9):241.6Maldonado V, De Anda J, Melendez-Zajgla J. Paclitaxeliduced apoptosis in hela cells is serum-dependent J. Biochem Toxicology, 1996, 11:546.7杨小明，张秀丽，夏磊，等. 反相高效液相色谱法测定小鼠血浆中银杏酸浓度J. 药物分析杂志，2009 ，29(4):620.8Dressman JB, Lennemas H. Oral drug absorption: Prediction and assessmentJ. Marcel Dekker, Ihc , 2000:51.9陆彬.药物新剂型和新技术，第 2 版M.北京: 人民卫生出版社, 2005：384.10孙进.现代药物制剂丛书-口服药物吸收与转运M. 北京：人民卫生出版社, 2006：322.9