ModfitModfit 分析细胞周期指南分析细胞周期指南本指南只提供在 guava 流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据，其它请参 阅产品使用说明书，本指南仅供参考。一概述 细胞周期的概念：细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束，都要经历相同的变化阶段(即 G1SG2M )周而复始地进行活动，细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)。尽管在各种细胞中各期 所占时间都不尽相同，但相对而言 M 期最短，S 期却较长。 分裂间期： 1 、G1 期 ，前一次有丝分裂完成到 S 期开始。各种与 DNA 复制有关的酶明显增多，线粒 体、叶绿体、核糖体增多，内质网在更新扩大，高尔基体、溶酶体都增加，中心粒彼此分 离、复制。 2、S 期：DNA、组蛋白合成 3、G2 期， S 期结束后到有丝分裂开始。由上可以看出 G2 期 、S 期、M 期反映了细胞的 增殖活性，特别是 G2 期 、S 期（因 M 期较短） 。因而，G2/M+S反映了细胞增殖能力。 二者有无差别要进行统计检验。 细胞周期阻滞：对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞)，由于细胞不断的增殖， 细胞总是处于从 G1 、S、G2 和 M 期的连续的细胞周期中。 在细胞周期的各阶段， 细 胞分别进行着 DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。每一阶段都是下一 阶段的准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生 化事件，这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理 阶段的能力，而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。只有前一阶段的生理活动 完成后，才能通过称为检定点的阶段，进入周期的下一步，一些突发事件引发的细胞反应 能影响驱动细胞周期前进的因子，从而使细胞周期停滞在检定点， 这被称为细胞周期阻滞 (cell cycle arrest)。 比较相应的细胞 G1 、S、G2 期差异有无统计学意义，才能说有无细胞周期阻滞。第一张图：增值率 S（合成期）G2/M（合成后期/分裂期）：21.7第二张图：增值率 S（合成期）G2/M（合成后期/分裂期）：19.6 据此分析两者的增值没有明显的差别。虽然第二张图比第一张图的 S 期有所增高，但 G2 期下降了。 细胞周期是基于细胞处于不同分裂时期具有不同的 DNA 含量而分析细胞处于不同的时期的 方法。确切的说结果中 G1 期的百分比实际上是 G1G0 期细胞的百分比。 G2 的百分比实 际上是 G2M 期细胞的百分比。二细胞样品制备 在样品的制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，虽然细胞通透剂种类很多，但用于 碘化丙啶（PI）染色进行细胞周期和倍体分析的细胞通透剂，通常为 70冷乙醇；乙醇必 须与细胞充分快速混匀，避免细胞聚集成团；乙醇必须与细胞充分快速混匀，避免细胞聚 集成团；流式细胞仪获取细胞的速度不宜太快，在 guava 上要使用最低速。 1. 用户首先使用 guava 的细胞周期试剂盒，并按相应的操作步骤进行细胞固定、染色后， 使用 guava 的细胞周期模块进行数据采集和分析，并生成以.ccy.CCY.FCS 为后缀的文件。 2. 细胞周期结果受样品制备的影响较大，请参阅相关文献进行样品制备。 3. guava 细胞周期试剂盒简要操作步骤： 1) 制备 70%的冰乙醇, -20C 预冷 2 小时 2) 制备单细胞悬液,收集细胞,离心去除培液,用 PBS 重悬 3) 离心,去除 PBS. 加入 100ulPBS 重悬. 4) 将 100ulPBS 逐滴加入 7ml70%的冰乙醇中固定过夜 5) 固定后,450g 离心 5 分钟,弃固定液,用 3mLPBS 重悬. 6) 再次离心, 弃 PBS,留细胞在离心管底部, 加入 500ul Cell Cycle 试剂 7) 染色 30 分钟后上机检测. 4. 请注意在固定步骤中，加入2070%酒精（1 到 2ml）打匀，固定，至少半个小时以 上（约 100ul 细胞用枪一滴一滴加入到 7ml 装有预冷 70%冰乙醇（-20 至少 2 小时）中，每 加一次都需要反复吹打，以避免细胞成团；需要注意的就是加酒精固定的时候要用 4预 冷的酒精，缓慢的加，边加边晃动细胞，避免细胞黏连在一起。 ） ， （不做的话，可放入 4 冰箱保存 2-3 周问题不大。 ）另在用预冷 PBS 洗去固定剂时，不宜洗得过多，以免细胞损失。三Modfit 操作指南 1. 双击 Modfit 图标，打开 Modfit 软件（无需安装） ，打开界面如下：不用理会弹出的信息，点击 OK 继续，会出现下述界面，每个均点击 OK 即可：2. 点击 File，在弹出的对话框中选中要分析的细胞周期文件（FCS3.0 文件） ，点击 open 以 打开文件：3. 打开文件，可以看到该文件包含 10 个数据文件，如果分析第一个文件，则选中第一个 文件（如要在分析完第一个文件再分析第二个文件，需要关闭软件后，再次打开软件，重 复上述过程，再在打开文件后出现的 10 个数据文件中再选中第二个进行分析，其它 8 个数 据文件分析方法同上） ，点击 OK 以打开该数据文件：4. 在选择参数（Choose parameter for analysis）时选择第五个（FL2-P-PM2Max）：5. 选择右下脚的 Convert 按钮，在下述界面的 Linear-to-Log Conversion 下选择第六个（FL2- W-PM2Width） ，点选 Convert to log 前的方框，再选中 OK 继续：6. 软件会回到前一界面，点击 OK 继续：7. 在下述界面中点选 Enable Gate 1，并选中 Define Gate 1 按钮进行设门：8. 在下述界面中左侧（X Parameter）选第六个参数（FL2-W-PM2Width） ，右侧（Y Parameter）选择第五个参数（FL2-P-PM2Max） ，点击 OK 继续：9. 选中图中的黑色方框，当出现+字形调整其位置，正常的细胞周期细胞应为上下两群细 胞的哑铃形状，并调整方框的大小，以去除碎片及粘连细胞：10. 调整完成后，点击 OK 按钮，软件会回到设门的界面，点击 OK 继续：11. 软件会出现设门的细胞及细胞周期的峰图：12. 选择 Analysis 下的 Sync Wizard 中的第一个 Create or edit model:13. 软件出现下述细胞周期的设置界面，分别进行 G0/G1、G2/M 和 S Phase 的设置，调整 时可选择其中的红色三角改变 G0/G1、G2/M 的位置，一般选择默认即可（如不想设置，可 直接选择第二排的 Auto 按钮进行自动分析）：14. 设置完成后，点击 Analysis 即可自动完成分析过程，并出现分析结果如下，左侧为拟合 的细胞周期图，右为统计数据：15. 选择 Edit 下的 Copy 按钮，即可将分析结果和图形复制到 Word 文档或 PPT 文档中：16. 下图为复制到 Word 文档后的情况：请注意，本指南不排除其编写内容可能有不准确甚至错误的地方，仅供各位在做细胞周期 时参考。具体产品使用方法及注意事项，请参阅详细的产品使用说明书以获更详细的使用 方法。指南的编写得到北京医科大学的孙玉芳老师的大力协助，在此深表感谢。默克密理博生物科学部默克密理博生物科学部上海上海市浦东张江高科技园区晨晖路88号二号楼2楼邮编：201203电话：021-38529152传真：021-53060838北京北京市朝阳区曙光西里甲5号院凤凰置地广场A座写字楼18层邮编：100028电话：010-59898600传真：010-57623560广州广州市黄埔大道西638号富力科讯大厦803A室邮编：510627电话：020-37883048传真：020-37883072成都成都市芷泉街229号东方广场C座11楼7号邮编：610061电话：028-85288550传真：028-85288553