Genetic Engineering1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术3 基因工程的基本条件C 用于基因转移的受体菌或细胞B 用于基因克隆的载体A 用于核酸操作的工具酶A 用于核酸操作的工具酶3 基因工程的基本条件限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成 小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰 所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割 。（2）修饰（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上 C5位置上引入甲基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性 I 型 II 型 III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAMATP Mg2+ SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠 杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGCI型限制性内切酶 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约10001500 bp处随 机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从 流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind 型限制性内切酶 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同 酶分子组成,分子质量小,能识别DNA的特殊序列, 种类多,在基因工程中起重要作用.III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要 ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名H i n d III H i n d IIIHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列EcoR I的切割位点EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstI等产生的3粘性末端 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP连接便利 粘性末端的意义i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。 补平成平齐末端凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚 核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工 粘性末端。 5末端标记 凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行 32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端 。PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同裂酶（Isoschizomers) 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I 、Bgl 、Bcl I、Xho 等 同尾酶(Isocaudamers）5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点 一般不能再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3AII 型限制性核酸内切酶的识别序列与DNA的切割 限制酶识别序列与DNA的来源无关,不具有种的特异性 识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率 识别序列的相邻序列效应 限制酶的偏爱现象 限制酶的星号活性限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位 引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素酶活性单位：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标 准DNA所需的酶活性定为1U酶用量：当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的 用量视酶的催化活性而定。容积活性：1ul酶溶液中具有的酶活性单位。根据完全切割1 gDNA所需酶量来换算。限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即 所谓的Star activity现象 EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘 油浓度超过50%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者 5AATT3五种缓冲液：A B H M L，每种酶只有在最适的反应 缓冲液中才具有最强的催化活性。影响限制性核酸内切酶活性的因素酶切消化反应的温度： 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数 是37 oC，少数要求40-65 oC。酶酶最适温最适温 度度o oC C酶酶最适温最适温 度度o oC C酶酶最适温最适温 度度o oC CApaApa I I BclBcl I I Mae II Mae II TaqTaq I I30 30 50 50 50 50 6565ApyApy I I BstEBstE II II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I Mae I SmaSma I I50 50 45 45 2525限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCl50 mM pH 7.5 MgCl210 mM NaCl0 - 150 mM DTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶Volume20 - 100 ml T T37 1 - 1.5 hrMgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，DNA连接酶DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA