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实验五 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、实验目的n1学习测定淀粉酶活力的方法。n2了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、实验原理n休眠种子中主要含有-淀粉酶,而-淀 粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发 时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加, 将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长 。n-淀粉酶水解非还原端的第二个-1,4- 糖苷键,水解产物为麦芽糖。u淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。u在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 三、试剂 n1. 0.1标准麦芽糖溶液 20毫升:精确称量 100毫克麦芽糖,用少量水溶解后,移入 100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度。n2pH 6.9,0.02摩尔L磷酸缓冲液 100毫 升n31淀粉溶液100毫升:1克可溶性淀粉溶 于100毫升 0.02摩尔L磷酸缓冲液,其中含 有 0.006摩尔L氯化钠。n413,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔L的氢 氧化钠溶液和50毫升水中;再加人30克 酒石酸钾钠,定容至100毫升。若溶液 混浊,可过滤。n51氯化钠溶液300毫升n6海砂5克四、操作步骤n1种子发芽:n小麦种子浸泡2.5 h后,放人25恒温箱内或在室温下发芽。n 2 酶液提取:n 取发芽第三天或第四天的幼苗15株,放人 乳钵内,加适量石英砂,加 1氯化钠溶液10 毫升,用力磨碎。在室温下放置 20分钟,搅 拌几次。将提取液离心(1500转min)6 7分钟。将上清液倒人量筒,测定酶提取液的 总体积。进行酶活力测定时,将酶提取液用 Ph6.9的磷酸缓冲液稀释10倍。n取干燥种子15粒作为对照(提取步骤同上)。n3酶活力测定:n (1)取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂(各试剂须25预热10分钟)。1(干种子 )2(湿种子 )3(标标准管 )4(空白管 ) 酶液0.50.5-标标准麦芽 糖溶液-0.5-淀粉溶液1111蒸馏馏水-0.5n将各管混匀,放在25,水浴中保温3 分钟后,立即向各管中加人1 3,5-二 硝基水杨酸溶液2毫升。(?)n(2)取出各试管,放人沸水浴中加热5 分钟。冷至室温,加水稀释至25毫升。 将各管充分混匀。n(3)用空白管作对照;在500nm处测 定各管的光吸收值,记录结果。n4计 算n本实验规定:25时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。n根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系,即:A标准A未知C标准C未知nC(酶液管浓度)A酶C标准A标准n则15粒种子或幼苗的总活力单位= C酶N酶V酶nN为酶液的稀释倍数nV为提取酶液的总体积
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