微生物过量合成丙酮酸 及代谢网络分析1研究背景 为什么要研究发酵法生产丙酮酸? 本研究的立题意义何在? 关于丙酮酸的生物合成，国外的研究进 展如何?2 丙酮酸是糖代谢中最重要的中间产物。 它位于合成代谢与分解代谢的转折点， 在生物能量代谢中具有十分重要的作用 。 在化工、制药和农用化学品等工业及科 学研究中有着广泛的用途。 为什么要对发酵法生产 丙酮酸进行研究?3丙酮酸的主要用途4 丙酮酸的化学法生产工艺 酒石酸脱水脱羧法目前用的主要生产方法：将 酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 下蒸馏，馏 出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。 其主要缺点是 (1) 丙酮酸产率较低(对酒石酸质量产率为0.29 0.30 g/g)； (2)得到1 g丙酮酸需要消耗5 g硫酸氢钾 以目前酒石酸(1.5 万元/t)和硫酸氢钾(0.6 万元/t) 的市场价格计算，仅原料成本就至少需要8 万 元/t导致丙酮酸的价格居高不下。5 丙酮酸的发酵法生产 发酵法生产丙酮酸在成本上具有明显优势。 问题是丙酮酸高产菌株的选育非常困难。 日本已经实现了发酵法丙酮酸的工业化生 产，但在我国，尚未见到任何专利或研究 报告。6 酵母直接发酵法生产丙酮酸 国外研究水平 细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸 休止细胞法生产丙酮酸 完整细胞(或酶法)生产丙酮酸7酵母直接发酵法生产丙酮酸丙酮酸脱羧酶(PDC) 转氨酶(PT) 丙酮酸羧化酶(PC) 丙酮酸脱氢酶系(PDH)烟酸(NA) 维生素B1(B1) 维生素B6(B6) 生物素(Bio)8 酵母直接发酵法生产丙酮酸(表1)9 酵母直接发酵法生产丙酮酸(表2)10 细菌或放线菌直接发酵法生产丙酮酸11休止细胞法生产丙酮酸12完整细胞或酶法生产丙酮酸13 以获得丙酮酸高产 率、高产量和高生产强 度的相对统一为目标。 尽量减少丙酮酸的降解或转化。 本研究的学术思想是什么? 尽量加快由葡萄糖到丙酮酸的代谢速度。14 国外同类研究有哪些问题? 具有多种遗传标记的Torulopsis glabrata在摇瓶 培养中丙酮酸产量和产率已分别达到56.8 g/L 和0.58 g/g (日本) 在3 L发酵罐流加培养中，丙酮酸产量可达67.8 /L，其代价是丙酮酸产率(Yp/s)仅为0.49 g/g15 找出对发酵过程最重要的影响因素。 对一种产品，怎样获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一? 提出相应的控制方法或策略。 对这些因素的影响规律进行生理学分 析。16 T. glabrata生产丙酮酸存在的问题(1) 均以蛋白胨为氮源，产率最高仅为0.58 g/g。(2) 所缺陷的维生素在丙酮酸过量合成中的调控作用 及影响次序如何?(3) 发酵过程中，溶氧控制在什么水平好，应当怎样 控制?(4) 怎样全面提高丙酮酸的发酵水平?17本研究目标学术目标透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸 的生理学本质，采用一系列控制策略实现丙酮 酸的过量合成。应用目标确定可放大的发酵工艺，完成300 L 规模的发酵试验，为实现工业化奠定基础。18本课题的主要研究内容1. 营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响2. 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用3. 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式5. 光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征4. 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析191. 营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响(1) 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用(2) 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式(4) 光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征(3) 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析 光滑球拟酵母WSH-IP12是一株多重维生素 营养缺陷型 确定较佳的营养条件是优化发酵过程的基础 性工作研究思路20本部分主要研究内容 氮源种类(酵母粉、蛋白胨、豆饼水解 液、无机氮源)及其浓度的影响 供氧方式和碳氮比的影响 流加培养中氮有效供给的重要性21氮源种类及其浓度的影响酵母粉添加量的影响(g/L): zero； 1； 3； 5； 8； 1022蛋白胨添加量的影响 丙酮酸； 乙醇； 细胞干重； 葡萄糖 23豆饼水解液添加量的影响 丙酮酸； 细胞干重 24无机氮源的影响25氮源种类及其浓度的影响小结1) 酵母粉质量浓度大于1 g/L将导致丙酮 酸产量大幅度减少。2) 虽然该菌株能够利用豆饼水解液和无 机氮源，但结果不如蛋白胨理想。26供氧方式的影响 and 0-39h, 700 rpm； and 0-6h，400 rpm; 6-14h, 500 rpm; 14-37h, 600 rpm 供氧方式和碳氮比的影响27不同供氧方式控制的发酵过程参数比较28培养基碳氮比的影响 glucose 92 g/L, peptone 15 g/L glucose 127 g/L, peptone 20 g/L glucose 201 g/L, peptone 20 g/L29培养基中初始葡萄糖浓度和/或碳氮比的影响30供氧方式及碳氮比的影响小结1) 较高的溶氧水平下，细胞生长和葡萄糖消 耗速度相对较慢，但丙酮酸产量(39.0 g/L)和 产率(0.47 g/g)较高。2) C/N太高(如42:1)，细胞消耗葡萄糖的能力被 削弱，且丙酮酸产率下降。在C/N适宜的条 件下(25:1)，丙酮酸发酵能正常进行。31在摇瓶发酵中补加葡萄糖的影响 补加葡萄糖； 不补加葡萄糖 流加培养中氮有效供给的重要性32典型的流加培养过程曲线 丙酮酸； 葡萄糖； 细胞干重； 乙醇33 丙酮酸； 葡萄糖； 细胞干重； 乙醇以氨水代替KOH控制pH的流加培养过程曲线34营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用丙酮酸分批发酵的供氧控制模式光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征丙酮酸发酵过程的代谢网络分析本课题的主要研究内容35 已有的研究没有阐明光滑球拟酵母的维生素 营养缺陷型对维生素的确切需求 其原因可能是培养基成分较为复杂 开发简单的培养基，是研究维生素在丙酮酸 过量合成中作用的基础性工作 WSH-IP12菌株对无机氮源的同化能力不强， 需要改进研究思路本部分主要研究内容 突变株WSH-IP303的获得及其对无机氮源的 同化能力 维生素在突变株WSH-IP303过量合成丙酮酸 中的重要作用36突变株WSH-IP303的获得方法EMS 处理后的细胞涂布CM平板，挑取CM平板上透明 圈大的菌落，对应点种CM和MM。挑取CM平板上生长良好而MM平板上不生长或生长 很弱的菌落，进行初筛。复筛前，先确认突变株的维生素营养缺陷型遗传标记。根据丙酮酸产量高低和产酸稳定性，确定研究用菌株。37初筛得到的54株菌合成丙酮酸能力388株较优突变株的传代稳定性39突变株WSH-IP303利用不同氮源生产丙酮酸的能力 peptone； (NH4)2SO4； (NH4)2HPO4； Urea； NH4Cl40突变株WSH-IP303的获得及其 对氮源的同化能力小结1) EMS诱变后有8株菌，丙酮酸产量提高30%以上。 WSH-IP303生产丙酮酸的能力强且稳定，其丙酮 酸产量(35.1 g/L)比出发菌株提高了64%。2) WSH-IP303菌株以NH4Cl或尿素为唯一氮源时的丙 酮酸产量高于蛋白胨。3) 成本降低；可以透彻分析维生素的影响。41本部分主要研究内容 突变株WSH-IP303的获得及其对无机氮 源的同化能力 维生素在突变株WSH-IP303过量合成丙 酮酸中的重要作用42维生素对突变株WSH-IP303生产丙酮酸的单因素影响43正交试验维生素水平表44正交试验设计及具体实验结果45正交试验直观分析 pyruvate; growth; Glucose consumption; Yield46由正交试验得到的维生素浓度优化组合1 Combination for getting high yield of pyruvate to glucose.2 Combination for getting high concentration of pyruvate.47维生素浓度优化组合的实验验证48烟酸和硫胺素较优浓度的确定得到了维生素浓度优化组合NA 8 mg/L，B1 0.015 mg/L，B6 0.4 mg/L，Bio 0.04 mg/L，B2 0.1 mg/L。49采用实验得到的 维生素浓度优化组 合在5 L罐上进行分 批发酵试验 Glucose Pyruvate NH4Cl DCW1, DOT 2, ethanol Yp/s; Yx/s.50丙酮酸脱羧酶 转氨酶 丙酮酸羧化酶 丙酮酸脱氢酶系维生素浓度的优化是提高丙酮酸发酵水平的先决条件51维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用小结1) B1是影响丙酮酸生产最重要的因素。2) 增大NA质量浓度可促进葡萄糖消耗。3) 得到了维生素浓度优化组合NA 8 mg/L，B1 0.015 mg/L，B6 0.4 mg/L，Bio 0.04 mg/L，B2 0.1 mg/L，为进一步研究奠定了基础。52营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式光滑球拟酵母过量合成丙酮酸的代谢特征丙酮酸发酵过程的代谢网络分析本课题的主要研究内容53 较高的溶氧有利于丙酮酸的积累 溶氧高到什么程度好? 在发酵过程中怎样对溶氧实施控制? 维生素限量供给后溶氧的影响会不会出现特 殊性?研究思路本部分主要研究内容 分析不同kLa下突变株WSH-IP303分批发酵的 动力学特征 根据主要动力学参数的变化特性，提出了分 阶段供氧控制模式54不同kLa下发酵过程中溶氧的变化kLa (h-1): 1450; 2300; 320055不同kLa下发酵过程动力学曲线kL a (h-1) : and 1 450 and 2 300 and 3 20056不同kLa下丙酮酸产率和细胞产率的变化kLa (h-1): 1450; 2300; 320057不同供氧控制模式下发酵过程参数比较58 高kLa (450 h-1)下，丙酮酸产率较高(0.724 g/g)，但 葡萄糖消耗速度较慢(1.14 g/(Lh)。 低kLa (200 h-1)下，细胞消耗葡萄糖的速度加快(1.97 g/(Lh)，然而丙酮酸产率(0.483 g/g)却明显下降。不同kLa下突变株WSH-IP303分 批发酵的动力学特征小结59本章主要研究内容 分析不同kLa下突变株WSH-IP303分批发 酵的动力学特征 根据主要动力学参数的变化特性，提 出了分阶段供氧控制模式60不同kLa下发酵过程动力学曲线kL a (h-1) : and 1 450 and 2 300 and 3 20061恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡 分阶段供氧控制模式发酵0-16 h控制kLa为450 h-1 ，16 h后将kLa降低至200 h-1。62分阶段供氧控制模式下的发酵过程曲线 Glucose Pyruvate Biomass 1 DOT 2 Ethanol63分阶段供氧控制模式下的碳平衡恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡64 分阶段供氧控制模式，实现了高产量(69.4 g/L)、 高产率(0.636 g/g)和高葡萄糖消耗速度(1.95 g/(Lh) 的相对统一。分阶段供氧控制模式小结 生产强度(1.24 g/(Lh)比kLa恒