第三部分中药色谱指纹图谱研究程序Research Procedure of TCM Fingerprint主 要 内 容 中药指纹图谱建立技术规范总则； 中药材指纹图谱建立技术规范说明； 中药注射剂和中间体指纹图谱建立技术规范 说明； 中药指纹图谱建立技术规范总则说明； 色谱条件选择和优化SFDA关于中药注射剂指纹图谱的技术要 求 (暂行) 中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术 指南(试行)为了加强中药注射剂的质量管理，确保中 药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂 在固定中药材品种、产地和采收期的前提 下，需制定中药材、有效部位或中间体、 注射剂的指纹图谱。 一、中药指纹图谱 建立技术规范总则 1 供试品收集 供试品收集是实验研究指纹图谱最初也是最 关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有 样本进行实验，而且生长环境条件对药材代 谢产物有影响，所以要收集有代表性的样品 。收集不少于10批供试品的含义是指样本的 数和量要有足够的代表性。11 原料药 材 在药材的化学成分与中医临床疗效之间关联尚未能阐明的现阶段，基本 上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验 研究。原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研 究其指纹图谱是以此作为选择原药材料投料或混批提取的依据，同时作 为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础；药材的“批”不是工业生产的“批”，是指相互独立的供试品，即不能将同 一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干份样品，以保证试验结 果的代表性。为使指纹图谱能代表所表征药材的内在质量特征，不同批 药材应首先包括各主产地药材，其次考虑不同其它产地和不同购买时间 的不同批药材样本；由于收集药材样品受主观和客观的条件限制，供实验的供试品严格讲均 没有统计学的意义，所以样品数越多越好，l0批是最低的要求。供试品 应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：供试品来源 、 采集时间(购买时间)及采集人 、基原鉴定及鉴定人 、质量评估 、供试样 品的留样、贮藏和标签（留样数量应不少于实验实际用量的3倍。以保证 实验结果有异议时的可追溯）。 1.2 半成品（中间体）和成品（制 剂） 半成品及注射剂成品均应有10批以上 的样品供实验，以保证指纹图谱的可 重复性； 各批供试样品须有留样 。2 试品溶液的制备 21药材供试品溶液的制备取样 供试品取样应注意代表性，以保持实验室取样与实际生 产应用药材一致，例如地上部分的药材，取样约o5lkg ，分别称量茎、叶、花、果的大致比例并做记录。如果实类 药材，生产时去除种子的，供试品也应除去种子，并做记录 。如药材表观质量不均匀(如大小不一、肥瘦不等、粗细不 匀等)，应注意供试品的取样有代表性，其后的实验中，必 要时应做比较实验，以考察所含成分有无显著差异，供生产 参考。 称 样 应按照常规要求，将选取的样品适当粉碎后混合均匀 ，再从中称取试验所需的数量，一般称取供试品与选 取样品的比例为1：10，即如称取1g供试品，应在混 合均匀的10g选取的样品中称取。因为指纹图谱需要 提供量化的信息，称取供试品的精度一般要求取3位有 效数字。 制 备 药材指纹图谱的主要目的，一是考察药材本身的质量情况， 二是以药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与 之比较，以考察制剂与原药材的相关性。 药材供试品溶液的制备，可选用适宜的溶剂和提取方法，定 量操作进行，尽量使药材中的成分较多地在色谱图中反映出 来，并达到较好的分离。 最终制备的供试品溶液还应能适应色谱实验的需要，如液相 色谱的供试品溶液宜用色谱流动相或色谱洗脱强度较弱的溶 剂； 气相色谱的供试品可采用水蒸气蒸馏法、顶空进样法或固相 微萃取法，供试品如需使用溶剂，应用低极性低沸点的溶剂 。 定容与放 置 供试品溶液最终应用适宜的溶剂于标定容量的容器， 制成标示浓度的供试品溶液(gml或mgml)； 一般要求供试品溶液尽量新鲜配制，如连续实验需 要，供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下短 期放置，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超 过48小时。22 半成品(提取物，中间 体) 供试品溶液的制备 称取不同批次的半成品(提取物)，参照“供试 品溶液”的制备方法中相应的内容制备成一定 量的溶液，备用。标签须注明编号或批号， 应与取样的药材编号一致，或有明确的关联 ，以保证数据的可追溯。主要操作过程及数 据应详细记录。23 成品(注射剂)供试品溶液制 备 液体注射剂一般可直接或稀释后作为供试品溶液，必要 时也可用适宜的溶剂提取并制备成一定量的溶液。固体 形式的注射剂(冻干粉针)须注意注射剂成品的附加剂有 无对色谱实验干扰。如有干扰，须研究采取适宜的样品 预处理方法以排除干扰(如含有氯化钠则液相色谱不可 使用蒸发光散射检测器；如糖分太多，可能影响薄层色 谱的清晰度和分离度；冻干粉针的骨架剂用量较大时也 可能影响色谱的质量等)。此外，单方注射液药材或复 方注射剂中不同药材成分类别如果相差较大，色谱条件 要求不同，需要进行样品的预处理时，应分别进行试验 ，便于制备两个以上的指纹图谱。主要步骤及数据应详 细记录。3 参照物31参照物的选择 指纹图谱的参照物质一般选取容易获取的一个以上注射剂中的主 要活性成分或指标成分，主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重 现性，并有助于色谱的辨认。在与临床药效未能取得确切关联的 情形下，参照物(复方注射剂应首选君药的活性成分或指标成分) 起着辨认和评价色谱指纹图谱特征的指引作用，它并不等同于含 量测定的对照品。指纹图谱一般色谱比较复杂，内标物不易选择 ，也不易插入，指纹图谱不是含量测定，故内标物的作用也不等 同于含量测定的内标物，因此应慎重考虑选用内标物质的必要性 和可能性。参照物应说明名称、来源和纯度。如无参照物，可选 择指纹图谱中的稳定的色谱峰作为参照峰，说明其色谱行为和有 关数据，并应尽可能阐明其化学结构及化学名称。如情况需要， 且有可能，也可考虑选择适当的内标物插入色谱中。32参照物溶液的制备 精密称取样品，用适宜的溶剂制成标示浓度的溶液，备用。4 实 验 选用的原则都是良好的专属性、重现性和可行性；专属性： 建立的指纹图谱必须能够表达该品种的惟一特点，即惟一性 ；重现性：同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹的各特征峰作为整体( 峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例)在不同实验室和不同操作者 之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度，以表明方法的可行性。 同一品种不同样品之间的相似度不属于此范围；可行性：色谱方法和试验条件应易于推广和便于执行，即一旦由药品 监督管理部门批准成为质量标准的内容后，生产厂家、中等水平的分 析实验室和省级以上的法定检验机构均可执行该标准。41 仪 器 所用的仪器性能应能满足指纹图谱实验的需要，并须经校验；如果同一 台仪器有两个以上的项目共用，须有特别措施保证仪器的清洗和维护， 仪器使用要有明确记录。液相色谱柱记录商品名称、生产厂家及相关参 数(固定相、柱长度、内径、填料粒度等)；一般用3根以上的不同生产 厂家的柱子进行比较，经比较实验后应固定色谱柱来源与规格。色谱系 统的适应性实验可用该品种指纹图谱所用的参照物，参照常法进行，如 柱效明显降低，在排除其他因素后，说明该色谱柱不能继续使用。另一 方法是用制作“标准指纹图谱”的提取物留样样品定期重复实验，将前后 得到的指纹图谱垂直叠加，直观比较，各指纹特征峰是否能重合及整个 色谱的形状是否有变异，如有变异致使指纹特征已难以辨认，或选择难 分离的一对或一组峰，其分离如明显降低，在排除其他可能的影响因素 后，可认为该色谱柱不能使用。仪器使用人、使用时间及周期应有记录 ；气相色谱如色谱柱类型、长度、内径、老化条件、载气、流速、柱温、 柱头压力、进样方式、进样口温度、检测器等均需考察；仪器除定期检 查校验外，填充柱或毛细管柱的柱效也应参照液相色谱柱定期校验柱效 。 42 指纹图谱研究的实验方法原则 （定性）色谱指纹图谱实验方法和实验条件的优选：实验条 件应能满足指纹图谱的需要，不宜简单套用含量测定用的实验条件，并 需根据指纹图谱的特点进行实验条件的优选。一个好的指纹图谱应是色 谱图应尽可能展示多的色谱峰 和使色谱峰达到基线分离； 实验方法和实验条件选择的目的是通过比较实验，从中选取相对简单易 行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱 的专属性、重现性和普遍适用性的要求，方法和条件须经过严格的方法 学验证； 由于色谱指纹图谱具有量化的概念，所以从样品的称取、供试液的制备 和进行色谱分析时均须定量操作。 实验中的注意 事项1 液相色谱的色谱柱 需用3根以上做比较实验加以 选择，流动相至少用三种不同组成进行比较，并从中 选取最合适的色谱条件。目前，高效液相色谱一般为 反相色谱，采用十八烷基硅烷键合相柱，特殊情况下 可选择其他类型的化学键合相柱。不同生产厂家不同 牌号的色谱柱因选用的硅胶原料、键合条件、封尾情 况的差异，致使在性能上互有差异，故通过实验比较 ，选择合适的色谱柱很重要，选用的色谱柱最好是多 数实验室常用的 ；实验中的注意事 项2 如需梯度洗脱时，应尽量采用线性梯度，并应报告仪 器梯度滞后时间。测定梯度滞后时间，可用一零死体 积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含O1丙 酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，运行0100 B的线性梯度，梯度时间20分钟，流速1Oml mm，记录梯度图形，测定梯度曲线中间点的时间， 减去10分钟，即得。不同的仪器，由于梯度滞后时间 的不同，可能影响方法的重现性，通常可通过调整进 样和梯度起始时间减少这种影响；实验中的注意事 项3 检测器 最常见的是紫外-可见光检测器，为了获取 多层次的信息，常常需要选择数个不同的检测波长 ，获取不同波长得到的色谱图，条件许可的可使用 二极管阵列检测器。对在紫外线区无吸收的化合物 ，也可选择其他类型的检测器，如差示折光检测器 或蒸发光散射检测器等。实验中的注意事 项4 气相色谱 通常使用毛细定管柱，如填充柱得 到的色谱虽然简单，但如确能表达该品种的指 纹特征，也可采用。一般极性与非极性固定相 均须比较，以确定选用合适的固定相。色谱运 行时间能保证供试品中的成分均能流出色谱柱 。如需要将相对保留时间作为固定的常数(“保 留指数”)，也可根据实际需要和可能选取12 个内标物质计算。如需程序升温宜采用线性升 温，避免复杂的多阶程序。 5 色谱指纹图谱的建 立 5.1 色谱条件的建立：考察确定进样量、流速、色谱柱、洗脱条 件、检测波长、色谱时间等条件； 5.2 色谱系统性实验：依据建立的色谱条件下，共有模式所标示 峰的相对面积。重现性考察，连续测试5批平行处理样品，主要考察样品前处理方法 稳定性；精密度考察，同一样品连续进样5次，主要考察仪器测试条件稳定性 ； 稳定性考察，同一样品不同放置时间（至少考察5个时间点，分日 内日间两种方式），主要考察样品测试条件下的稳定性。以上考察要求各峰考察的相对标准偏差RSD值5。 5.3 色谱指纹图谱（共有模式）建立：连续测试10批以上样 本，采用SFDA推荐使用的相似度分析软件建立样品的色谱指纹图谱 （共有模式）。5.3 色谱指纹图谱（共有模式）建 立 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物 的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间。根 据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材 的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定 指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。 5.4 共有峰的标 定 共有指纹峰面积的比值要求： 以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有 指纹峰面积与参照物峰面积的比值； 以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰(要求峰 面积相对较大、较稳定的共