第一篇第一篇 蛋白质化学蛋白质化学茶学与生物系张 剑第五节 蛋白质的理 化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学（一）蛋白质的重要性质第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化1.蛋白质分子的大小l 蛋白质的分子量：一般在 1万100万道尔顿(D)之间;l 测定方法：1）超速离心法2）凝胶过滤法3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法4）化学组成法测定茶学与生物系-生物化学蛋白质分子量测定1）超速离心法（沉降分析法）l 超速离心机：离心速度 60 000-80 000 r/min;l 基本原理：蛋白质分子在受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会 沉降。沉降的速度与蛋白质分子大小、溶剂的密 度和粘度有关。l 沉降系数：单位离心场力的沉降速度，用S表 示。 1S=10-13s第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学l 凝胶：交联葡聚糖，商品名称 为 Sephadex;l 条件：标准蛋白质和待测蛋白质必须 具有相同的分子形状（接近球体 ）。分子为线型或能被凝胶吸附 的蛋白质不能用此法测定。l 基本原理：蛋白质分子量测定2）凝胶过滤法(分子排阻层析法或分子筛层析 ）第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量茶学与生物系-生物化学茶学与生物系-生物化学lSDS:l基本原理：PAGE电泳时蛋白质的迁移率与分子的静 电荷多少以及分子的大小和形状有关；经过SDS和少量巯 基乙醇处理所有蛋白质带相同的负电荷，此时蛋白质的迁 移率主要取决于蛋白质的分子质量，而与原来所带的电荷 和分子形状无关。蛋白质分子量测定3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化十二烷基磺酸钠原态蛋白质？加入SDS后蛋白质单体分子构象发生改变，形成的SDS蛋 白质复合物的形状为长椭圆棒，迁移率与电荷和形状无 关，仅取决于相对分子质量。巯基乙醇破坏二硫键茶学与生物系-生物化学茶学与生物系-生物化学茶学与生物系-生物化学蛋白质分子量测定4）根据分子组成测定最低分子量l 基本原理：测定蛋白质中某一微量元素的含量，根据其信号换算出蛋白的最低分子量；l最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量，其 实真实分子量是这个组成成份的n倍。l如：肌红蛋白含0.335%的铁，最低M=16700用其 它方法测得实际为16900；牛血清白蛋白含Trp0.58%，最低M=35200，用其它 方法测得实际为69000，说明它只含2个Trp残基。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学（一）蛋白质的重要性质2.两性解离及等电点 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和 酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基 团除肽链末端的-氨基和-羧基外，主要还是多肽 链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、-羧基、 -羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的 pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白 质带电。 当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所 带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不 向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学（一）蛋白质的重要性质3.胶体性质 蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径 1-100nm之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。l 水化层：蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如-NH3 、-SH、-CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成一层水化层（水膜） 。l 电层：蛋白质颗粒表面带有同种电荷，相互排斥，因而蛋白质不易聚集沉淀。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学（一）蛋白质的重要性质3.胶体性质 蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。透析：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。（盐析）第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化透析透析只用于除盐类和小分子杂质只用于除盐类和小分子杂质透析透析只用于除盐类和小分子杂质只用于除盐类和小分子杂质茶学与生物系-生物化学（一）蛋白质的重要性质4.蛋白质沉淀1）定义：在一定理化因素影响下，蛋白质分子可因失去电 荷和脱水而失去稳定性，并发生凝聚作用，沉淀析出，这种 作用称为蛋白质沉淀。2）分类：可逆沉淀：属非变性沉淀，条件温和，通过改变溶液pH或 Pr所带电荷，Pr结构和性质没有变化，用透析等方法除去 沉淀剂后可复溶（盐析法和有机溶剂沉淀法）。 不可逆沉淀：属变性沉淀，条件强烈，破坏Pr胶体溶液稳 定性，也破坏Pr结构和性质，沉淀不能再重新溶解(加热沉淀 、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等）。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化+ +带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化层+带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉茶学与生物系-生物化学蛋白质沉淀3）常用方法高浓度中性盐加入大量的中性盐(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 破坏了蛋白质的水化层，中和蛋白质的电荷，而使 蛋白聚集沉淀，这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现 象称为盐析，用于蛋白质分离制备。实例：血清中加(NH4)2SO4至50%的饱和度，球蛋白先沉淀析 出，继续加至100%饱和度，则清蛋白沉淀析出。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学蛋白质沉淀3）常用方法有机溶剂沉淀法加入水溶性有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮破坏水 化膜，降低介电常数增加带电质点的相互作用影响 双电层，而使蛋白聚集沉淀，用于蛋白质分离制备 。注意事项：a.低温操作; b.不能长时间接触；c.控制好量；实例：食品级酶制剂的生产；中草药注射液、胰岛素的制备第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学蛋白质沉淀3）常用方法重金属盐沉淀：Hg2+、Ag+、Pb+ （与蛋白质中带负电基团形成 不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构） 实例： 医疗上稀汞试剂消毒灭菌； 喝豆浆或牛奶解毒。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学蛋白质沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀法：在pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物 碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸；酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加热变性沉淀法：原因是蛋白质空间结构破坏疏水基团外露因而破坏了水化层。如同时处于等电点更容易沉淀，原因是影 响蛋白质的带电状态。如做豆腐。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学5.变性与复性蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构 发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之 改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变， 这种现象叫变性作用。 （一）蛋白质的重要性质第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学l次级键被破坏l天然结构解体l一级结构没有变化蛋白质变性与复性1）化学本质2）变性因素l物理：热、紫外线照射、高压和表面张力。l化学：有机溶剂、脲、胍、 酸、碱、重金属 阳离子、生物碱等。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学l生物活性丧失（酶）； l旋光性改变，溶解度降低，粘度增大，光吸收 性增强，扩散系数变小；l基团位置改变，疏水基团外露，分子结构伸展 松散，对蛋白酶敏感性增大。蛋白质变性与复性3）表征4）应用l有利：变性灭菌、消毒；变性制食品；临床分析l不利：衰老、皮肤变粗糙、干燥，。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学5.变性与复性（一）蛋白质的重要性质蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性（renaturation）。大多蛋白质变性后，很难复性。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性复性茶学与生物系-生物化学5.变性与复性（一）蛋白质的重要性质分类：可逆变性与不可逆变性沉淀与变性的关系：变性蛋白质并不一定都表现沉淀，而沉淀的蛋 白质也未必都已变性（如可逆沉淀）。不能复性的变性即不可逆变性一定产生沉淀， 不可逆的沉淀一定变性。制备活性蛋白质时要严防蛋白质变性。第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化茶学与生物系-生物化学6.蛋白质的颜色反应（一）蛋白质的重要性质1）双缩脲反应第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化l 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。l 双缩脲在稀碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子 中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能 起双缩脲反应。l 通常可用此反应来定性鉴定蛋白质；l根据反应产物的在540nm处颜色深浅，进行蛋白质水解 程度的测定及蛋白质的定量。茶学与生物系-生物化学2）黄色反应（定性鉴定）第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化l 蛋白质加浓硝酸白色沉淀变黄色 加碱变橙黄色。因为蛋白中芳香族氨基酸（Try 、Phe、Trp），苯基与浓硝酸起硝化作用，产 生黄色的硝基取代物，遇碱又形成黄色的盐（硝 基苯衍生物）。l 皮肤遇硝酸变黄蛋白质的颜色反应茶学与生物系-生物化学蛋白质的颜色反应3）米伦反应第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化l 含有酪氨酸的蛋白质，加入米伦试剂（HgNO3，HgNO2，HNO3，HNO2的混合液）反应，先产生白色 沉淀，加热后变成专红色。4）乙醛酸反应l 含有色氨酸的蛋白质，与乙醛酸混合后，沿壁慢慢加入浓硫酸，两液层之间出现紫色环。茶学与生物系-生物化学蛋白质的颜色反应5）酚试剂（Folin-酚试剂）反应第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化l 含酪氨酸蛋白能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物，（即钼蓝和钨蓝的混合 物）其在540 nm 有最大光吸收。6）乙醛酸反应l 蛋白质与考马斯亮蓝（G-250）染液反应产生 蓝色络合物，在595 nm有最大光吸收。蛋白质含量测定方法：凯氏定氮法紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法考马斯亮蓝法茶学与生物系-生物化学纯化的实质：增加制品的纯度或比活性。一般程序：（1）前处理（即提取）、（2）粗分级分离（3）细分级分离（4）浓缩与保存。（二）蛋白质的分离纯化第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化电泳前 处 理粗 分 离细 分 离生物组织 无细胞提取液破碎、溶 解、离心或差速离心选择性沉淀法亲和 层析离子交 换层析精制后的蛋白质凝胶 过滤疏水 层析吸附 层析保 存盐析、等电点沉淀、有机 溶剂分沉淀茶学与生物系-生物化学 分离纯化蛋白质的主要方法： 根据蛋白质的溶解度分离沉淀技术；根据电荷差异分离电泳技术； 根据分子大小分离分子筛层析及透析； 利用生物分子专一性结合的特性亲和层析；选择性吸附分离吸附层析；根据疏水性的差异。 （二）蛋白质的分离纯化第五节 蛋白质的理化性质与分离纯化透析透析