1青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用研究作者：钟振国 袁叶飞 周燕园 甄汉深 梁臣艳【摘要 】 目的确定广西特产药材青天葵体外抗肿瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制备主要采用溶剂法, 青天葵全草先用 95%的乙醇提取，得到的提取物进一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到极性由小到大的 4 个提取部位。活性筛选采用 MTT 法实验，观察青天葵提取物对 7 种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的体外抗肿瘤作用。结论首次确定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是体外抗肿瘤作用的有效部位。 【关键词】 青天葵 体外抗肿瘤作用 活性部位Abstract：ObjectiveTo determine the active fraction with anticancer effect in vitro from Nervilia foadii(Hance) Schltr.MethodsThe samples were prepared by solvent extraction. The whole Nervilia foadii(Hance) Schltr. was extracted with 95% ethanol at first,and then the ethanolic extract was separated with petroleum ether, ethyl acetate, n-Butyl alcohol and methanol in turn to get four fractions from 2small to large in polarity. The MTT experiment was made for active screening. The inhibiting influences of extracts from Nervilia foadii(Hance) Schltr. on growth of seven kinds of human tumor cells were observed. ResultsPetroleum ether extract and ethyl acetate extract both had some anticancer effects in vitro. ConclusionIt is the first time that the petroleum ether extract and ethyl acetate extract of Nervilia foadii(Hance) Schltr. are proved to be the effective anticancer fractions in vitro.Key words： Nervilia fordii(Hance) Schltr., Anticancer effect in vitro, Active fraction青天葵为兰科 Orchidaceae 植物毛唇芋兰 Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入药始载于岭南采药录 ，主要产于我国的广西、广东、海南，四川、云南，泰国也有分布，是广西特产药材1 3 ，具有清肺止咳、健脾消积、镇痛止痛、散淤消肿、清热解毒之功效，主治肺痨、咳嗽咳血、中毒、跌打损伤、小儿疳积、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等症。近来还用含有青天葵的复方制剂治疗鼻咽癌以缓解症状4 ，但未发现国内外对其抗肿瘤有效成分及药理作用的研究。为此，笔者对青天葵的干燥全草进行了药效学实验研究，对青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、3甲醇 4 个不同部位采用体外抗肿瘤实验进行初筛，为阐明青天葵的抗肿瘤作用并筛选出有效部位打下基础。现报道如下。1 材料与仪器1.1 受试样品药材青天葵来源于南宁药材站，经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为兰科 Orchidaceae 植物毛唇芋兰 Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。对青天葵的干燥全草进行提取分离得 4 个部位：石油醚提取物（A） 、醋酸乙酯提取物（B） 、正丁醇提取物（C） 、乙醇提取物（D） 。A，B，C 和 D 均用含有 DMSO 的培养液溶解，均配成浓度为 480 g/ml 的溶液，置于-20冰箱密闭避光保存。临用前用不含血清和抗生素的 RPMI1640（NG108-15 用 DMEM）液稀释至所需浓度，DMSO 终浓度在 0.01%水平。1.2 培养液1.2.1 RPMI 完全培养液含 RPMI1640 培养基（GIBCO ） 、3% 谷氨酰胺、卡那霉素 750 g/ml、10% FBS（临用前加） 。1.2.2 DMEM 完全培养液含 DMEM 培养基（GIBCO） 、卡那4霉素 750g/ml、10%FBS （临用前加） 。1.3 细胞株 白血病细胞株 L1210 和 P388D1、宫颈癌细胞株 Hela、人胃癌细胞株 SGC7901、黑色素瘤细胞株 B16、神经肿瘤细胞株 NG108-15 等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株 Hela7404 由广西医科大学药理教研室提供。1.4 试剂MTT（四甲基噻唑蓝）为德国 Sigma 公司产品，批号020609；FBS（胚胎牛血清）为美国 Hyclone 公司产品，批号0405；RPMI1640 和 DMEM 培养基为 GIBCO 公司产品，批号1120708 和 0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号 200503；DMSO（二甲基亚砜）由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号 20040526。1.5 细胞培养肿瘤细胞用含 10%灭活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15 肿瘤细胞用 DMEM）培养基在 37，15%CO2 条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。1. 6 仪器5Thermo Forma 型 CO2 培养箱，美国产；Olympus 型倒置显微镜，日本产；Biocell 型酶标仪，奥地利产；AG135 型电子天平，瑞士产；培养瓶，美国产；3072 型 96 孔板，丹麦产；3001型培养皿，美国产；DLF560 型超净工作台，荷兰产； HV-50 自动高压灭菌器，日本产。2 方法2.1 样品的提取分离将青天葵药材阴干，去除杂质，粉碎为粗粉，称取 9.0 kg 药材粗粉，用 95%乙醇（食用）浸泡 48 h 后渗滤提取，用 10 倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率 10.2%） 。将所得的粗提物用硅胶拌匀后，依次用石油醚（6090） 、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶剂，得石油醚部位 180 g，醋酸乙酯部位 87.5 g，正丁醇部位 86 g，甲醇部位 50 g。2.2 MTT 法取对数生长期细胞以 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA 消化后，用培养液稀释。在 96 孔培养板中每孔加入 200 l（含有 5 000 个6/ml 肿瘤细胞）含 10%FBS 的 RPMI1640 培养液，NG108-15 细胞则用含 10%FBS 的 DMEM 培养液，细胞置 37，10%CO2 培养 24 h 后，实验组分别加入最终浓度为 15，30 ，60，120，240 g/ml 提取物的培养液，对照组则加入等体积溶剂的培养液，每组4 孔，重复 4 次。置 37，10%CO2 培养 5 d 后，弃去上清液，加入 200 l/孔新鲜配置的含 0.2 mg/ml MTT 的无血清培养液，37继续培养 4 h，弃上清液，加入 200 l DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为 550 nm，参比波长为 450 nm 测定 OD 值。2.3 药物对肿瘤细胞生长的抑制率的计算方法5肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1- 实验组平均 OD 值）/ 对照组平均 OD 值100%2.4 半数抑制浓度 C50 的计算2.4.1 直线回归法6当细胞生长抑制率与药物浓度有对数关系时，以各个不同药物的对数浓度为横坐标，相应的细胞生长抑制率为纵坐标，求出直线回归方程，根据该方程计算出 IC50。2.4.2 改良寇氏法77当细胞生长抑制率与药物浓度不存在对数关系时，采用寇氏法计算 IC50。药物 IC50 值的公式为：IC50=lg-1Xm-i (p-0.5)。式中 Xm：设计的最大浓度的对数值； i：相邻两组浓度对数值之差；p：各组生长抑制率之和；0.5 ：经验常数。3 结果3.1 不同浓度提取物对白血病细胞株 L1210 的抑制结果见表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株 L1210 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算 IC50，IC50 分别为 83.5 g/ml和 76.2 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株 L1210 基本无活性。表 1 受试样品对白血病细胞株 L1210 抑制的影响(略)3.2 不同浓度提取物对白血病细胞株 P388D1 的抑制结果见表 2。石油醚部位和醋酸乙酯部位对白血病细胞株 P388D1 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度无对数关系，故采用寇氏法计算 IC50。IC50 分别为 60.8 g/ml 和 90.1 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位对白血病细胞株L1210 无活性。表 2 受试样品对白血病细胞株 P388D1 抑制的影响（略）83.3 不同浓度提取物对宫颈癌细胞株 Hela 的抑制结果见表3。石油醚部位和醋酸乙酯部位对宫颈癌细胞株 Hela 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求 IC50。IC50 分别为 39.5g/ml 和74.6 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位对宫颈癌细胞株 Hela 无活性。表 3 受试样品对宫颈癌细胞株 Hela 抑制的影响（略）3.4 不同浓度提取物对人胃癌细胞株 SGC7901 的抑制结果见表 4。石油醚部位对人胃癌细胞株 SGC7901 有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度存在对数关系，故以曲线回归法求 IC50，IC50 为 78.7 g/ml。醋酸乙酯部位、正丁醇部位和甲醇部位对人胃癌细胞株 SGC7901 无活性。表4 受试样品对人胃癌细胞株 SGC7901 的抑制的影响（略）3.5 不同浓度提取物对黑色素瘤细胞株 B16 的抑制结果如表5 显示，醋酸乙酯部位对黑色素瘤细胞株 B16 有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度不成对数关系，故以寇式法求 IC50，IC50 为 62.0 g/ml。石油醚部位、正丁醇部位和甲醇部位对黑色素瘤细胞株 B16 无活性。3.6 不同浓度提取物对神经肿瘤细胞株 NG108-15 的抑制结9果如表 6 显示，石油醚部位和醋酸乙酯部位对神经肿瘤细胞株NG108-15 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度成对数关系，故以曲线回归法求 IC50，它们的的 IC50 分别为 49.4 g/ml 和 54.9 g/ml。正丁醇部位和甲醇部位对神经肿瘤细胞株 NG108-15 基本无活性。表 5 受试样品对黑色素瘤细胞株 B16 抑制的影响（略）3.7 不同浓度提取物对人肝癌细胞株 Hela7404 的抑制结果见表 7。石油醚部位和醋酸乙酯部位对人肝癌细胞株 Hela7404 都有直接抑制作用，抑制率与提取物浓度成正比。细胞生长抑制率与药液浓度均成对数关系，故以曲线回归法求 IC50，IC50 分别为78.9 g/ml 和 41.5 g/m