细胞内蛋白质降解生命学院 张林生Chapter 5 1概述早在1940年代，H.Borsook和R.Schoenheimer用同位 素标记试验证明了活细胞组分不断进行更新。细胞不断地 用氨基酸合成蛋白质，又把蛋白质降解成氨基酸，这种貌 似浪费的过程实际上为细胞提供了防止反常蛋白积累以及 控制酶和调节蛋白总量的重要手段。每一种蛋白质在细胞内的数量一方面取决于它的合成 ，包括基因转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水 平的调控；另一方面则取决于它的降解。尽管直到1970代末才真正揭示了细胞内蛋白质选择性 降解的分子机制，无论如何，降解是维护细胞内蛋白质水 平不可或缺的控制步骤。无论何时对细胞内特定蛋白质的动态进行观察，就会发现 它像放射性同位素一样服从一级反应动力学。因此通常用半寿期表示其降解速率，即一种蛋白质合成之后被降解一半所用的 时间。细胞内蛋白质的半寿期并不相同，如表5.1所示，大鼠肝细胞酶类的半寿期多在鸟氨酸脱羧酶的11分钟到乳酸脱氢酶的19天的范围内。即使在同一细胞器内，蛋白质的降解速率也不相 同，如心肌线粒体中-氨基-酮戊酸合酶和鸟氨酸转氨甲酰酶比细胞色素的降解要快得多。这些现象暗示，蛋白质的半寿期取决于它特有的结构和细胞 内环境。蛋 白 质半寿期（h）短寿命蛋白质：鸟氨酸脱羧酶0.2-氨基-酮戊酸合酶1.1RNA聚合酶1.3酪氨酸氨基转移酶2.0色氨酸加氧酶2.5脱氧胸苷激酶2.6-羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶3.0磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶5.0 长寿命蛋白质：精氨酸酶96醛缩酶118细胞色素b5122甘油醛3-磷酸脱氢酶130细胞色素b130乳酸脱氢酶（同工酶5）144细胞色素c150透明质酸酶240表5.1 大鼠肝细胞一些蛋白质的半寿期当然，特定蛋白的降解速率以及细胞或组织中蛋 白质降解的总速率在不同生理条件下是可变的 ，如应答激素刺激或饥饿。另外，底物、产物、辅因子甚至药物也能影响一 种蛋白质在细胞内的降解速率，例如色氨酸加 氧酶在其底物色氨酸和辅因子血红素存在时降 解较慢；谷酰胺合酶在其终产物谷酰胺浓度增 大时加速降解。这种效应的分子机制尚不明了，但在生理上的合 理性显而易见，它保证在底物大量存在时酶保 持较高浓度，或者当产物过多时酶的水平适当 降低。1.1 蛋白酶为了尽快把蛋白质降解成氨基酸，细胞在进化中形成了 许多裂解肽键的酶，即所谓肽酶（peptidase）。肽酶按其作 用特点可分为肽链外切酶（exopeptidase）和肽链内切酶（ endopeptidase）。前者包括氨肽酶（aminopeptidase）和羧肽酶（ carbaxypeptidase），分别从肽链的N-端和C-端裂解肽键，每 次切下一个氨基酸。肽链内切酶即蛋白酶，作用于肽链内部 的肽键。细胞内蛋白酶种类繁多，分子大小和结构、作用机 制和调节机制以及亚细胞定位等差异甚大，前人按其活性中 心必需基团将蛋白酶划分为以下四类：羧肽酶及其活性中心的结构（1）丝氨酸蛋白酶（EC 3.4.21） ：其活性中心都有一个，Asp-His-Ser电荷中继网，通过 共价催化裂解特定的肽键，都受二异丙基氟磷酸（DIFP） 的抑制。丝氨酸蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）家 族和枯草溶菌素（subtilysin）家族，真核细胞的丝氨酸蛋 白酶均属前者，其中有许多是分泌型蛋白酶，如胰蛋白酶 、弹性蛋白酶、凝血酶、血浆激肽释放酶、脯氨酰基肽链 内切酶、精子头粒蛋白酶、组织蛋白酶G和R等。1.1.1.蛋白酶的分类胰凝乳蛋白酶枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶 及其活性中心 的结构胰蛋白酶- 胰腺胰蛋 白酶抑制 剂复合物游离的胰蛋白酶抑制剂（2）半胱氨酸蛋白酶（EC3.4.22）其活性中心都有Cys和His，通过共价催化裂解特定的肽 键，受低浓度对-羟基汞苯甲酸（pHMB）和碘乙酸等烷基 化试剂的抑制。按进化渊源可划分成三个家族：链球菌溶血 素（streptolysin）家族；梭菌蛋白酶（clostripain）家族和 木瓜蛋白酶（papain）家族，真核细胞半胱氨酸蛋白酶都属 于后者，主要存在于细胞溶胶和溶酶体（液泡）内，如组织 蛋白酶B、L和H、N、S、M、T、依赖金属的半胱氨酸蛋白 酶等。钙依蛋白calpain (calcium-dependent papain-like proteinase)是一种Ca2+激活的中性蛋白酶，由80kDa的大亚 基和30kDa的小亚基组成，在细胞溶胶中降解细胞骨架、受 体等长寿命蛋白和一些蛋白激酶。木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶及其活性 中心的结构（3）天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）活性中心有两个必要的Asp，主要通过广义酸碱催化 裂解特定的肽键，受抑胃肽（pepstatin）专一抑制。天冬 氨酸蛋白酶仅存在于真核细胞，分子量约3040kDa，如胃 蛋白酶、凝乳酶、肾素、组织蛋酶D和E等。胃蛋白酶天冬氨酸蛋白酶及其活 性中心的结构天冬氨酸蛋白酶 （4）金属蛋白酶（EC 3.4.24） 活性部位有必要的二价金属离子，绝大多数情况下是 Zn2+，有时为Ca2+ ，分子量17800kDa，受金属螯合 剂如EDTA等的抑制。金属蛋白酶中深入研究过嗜热 菌蛋白酶，其中的Zn2+直接参与肽键断裂，Ca2+大概 主要稳定酶分子的构象。属于金属蛋白酶的还有ER、 线粒体和叶绿体的信号肽酶、成纤维细胞胶原酶、白 明胶酶、脑啡肽酶、原胶原C-蛋白酶、meprin等。 还发现一些重要的蛋白酶不属于以上四类，如后 面要讨论的蛋白酶体、胱天冬蛋白酶等。嗜热菌蛋白酶金属蛋白酶及其活性中心 的结构ADAMTS,血管性血友病因子裂 解蛋白酶,是一种金属蛋白酶。Signal peptide信号肽 Pro-domain Metalloproteinase domain金属蛋白酶结构域 Disintegrin domain解离素结构域 Thrombospondin type血小板型 Cysteine-rich domain富含半胱氨酸域 Spacer region间隔区 Mucin-linke domain联域粘蛋白 Protease and lacunin me Pon-i-like motif Cubilin motif1.1.2 蛋白酶复合物（2）E.coli ClpAP蛋白 酶 （3）E.coli HslVU蛋 白酶（4）E.coli FtsH蛋白酶FtsH蛋白酶是位于膜上的依赖ATP的金 属蛋白酶参与细胞内膜蛋白和细胞质蛋白的各种降解过程。（5）Thermoplasma acidophilum Tricorn蛋白 酶 Tricorn蛋白酶是一种超分子体系的蛋白水解酶，主要表现寡肽酶活性，现 已基本弄清其组成、结构以及在蛋白质降解途径中的功能。从古细菌、原核细胞到真核生物，都有多个亚基组 成的、自我区隔化的（self-compartmentalization） 蛋白酶复合物：(1) E.coli LonLon 蛋白酶,Lon蛋白酶是一种在各种生物体内广泛分布并 且具有多种生物功能的蛋白质。科学发现，Lon蛋白酶在人体内负责把损坏的蛋白 质分解并清除掉，是一种天然抗氧化剂，该发现有助于制定合理的饮食结构，开发延缓衰老过程的新药。 ClpPE.coli HslVU蛋 白酶FtsH蛋白酶FtsH蛋白酶由分子量70-80 kDa 的同型或异型亚基组成六聚复 合体蛋白水解活性位点埋在六 聚复合体孔穴的中央。结构分 析表明原核生物和真核生物中 的Fts蛋白酶都具有共同的保守 模块Motif。在FtsH蛋白酶的N 端有两个跨膜域将其锚定在细 胞质膜上。其中第二个跨膜域 高度保守可以影响蛋白酶的水 解活性和蛋白的寡聚化。在跨 膜域的C端紧邻一个约2个氨基 酸的保守区域称为AAA结构域 。AAA结构域的ATP酶活性和 分子伴侣活性对于FtsH蛋白水 解活性的发挥十分重要。FtsH 蛋白酶的C端有一个锌离子结合 模块Zincbindingmoti与Zn2的结 合也是tsH蛋白酶催化活性所必 需的。FtsH蛋白酶Tricorn Proteinase1.2 蛋白质降解的生物学意义最近十几年对各类生物细胞内蛋白降解的研 究取得了长足的进展。以植物细胞为例，每个区 隔有一个或多个降解途径（图5.1）。图5.1 植物细胞中蛋白酶和蛋白水解途径的亚细胞定位 图示一个典型的植物细胞内和亚细胞房室已鉴定的蛋白酶。“？”表示原核蛋白 酶或尚待确认。Chloro ：叶绿体；ER：内质网，Mito：线粒体体外系统研究表明，哺乳动物细胞质至少有两类重要的 蛋白水解系统:溶酶体系统或酸性系统，主要负责降解外来蛋白、膜蛋白和 长寿命蛋白；泛肽-蛋白酶体系统或碱性系统，主要降解反常蛋白和短寿 命蛋白。与消化道内食物蛋白的消化不同，细胞内蛋白质降解是 高度受控制的复杂过程。细胞内蛋白质降解的一般特性：（1）大多数蛋白质降解需要能量，由于肽键水解是放 能的，大多数纯化的蛋白酶也与能量无关，因此细胞内蛋白 降解包括依赖能量的步骤，而且具有调控作用。（2）快速。很难探测到细胞内蛋白降解的中间产物， 这表明蛋白水解装置一旦遇到合适目标，立即将其彻底消化 ，避免降解中间产物的累积干扰正常的生理活动。 （3）蛋白酶的专一性较低，为了避免对细胞蛋白 质造成随机破坏，必须对它们进行严格的调控和区域化 。（4）细胞内蛋白水解是高度选择性的。即使在同 一细胞环境，不同蛋白质的半寿期从数分钟到数周，决 定其半寿期的信号常常是小的、保守的结构模体。该过 程不仅是复杂的基因功能调控级联的最后步骤，而且是 氨基酸再循环系统的组成部分。细胞发育阶段的转移和 对新环境条件的适应能力经常要求迅速拆除现存的调控 网络，这常常依赖于水解有关的蛋白质。蛋白质水解在 决定活性蛋白质最终浓度方面的优势在于它的快速和不 可逆性。细胞内蛋白质降解的生物学意义可概括为以下几个方 面：1.2.1 维持细胞内氨基酸代谢库的动态平衡 维持细胞家政和生长发育需要保证氨基酸代 谢库的动态平衡，以正常成年男子（体重70kg） 为例，体内的氨基酸代谢库需要保持在600700g ，每日从食物中吸收70100g，从组织蛋白降解中 回收300500g，新合成的3040g，合成组织蛋白 需消耗300500g，分解代谢消耗120130g，还有 少量用于合成其它含氮物质。1.2.2 参与细胞程序性死亡和贮藏蛋白的动员 生长发育伴随有细胞死亡，有时大批发生， 甚至整个组织器官，有时仅局限于少数或个别细 胞。这是个有特定目标、特定时间、由内外信号 启动的极其复杂的过程。在此期间细胞内蛋白质 经专一的水解途径转变成氨基酸，转运至其它组 织用于生长或贮藏。例如叶片和花衰老时70%以上的蛋白质被水解 回收。木质部和厚壁组织的分化、花粉开裂前绒 垫层的分解以及种皮、周皮的成熟，都涉及部分 细胞有计划的死亡。此外，种子萌发时贮藏蛋白 的动员等过程，均涉及蛋白降解途径。1.2.3 按化学计量累积寡聚蛋白的亚基或脱辅基蛋白/辅因子比率 例如在Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶Ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase. 是光合作用C3碳反应中重要的羧化酶,也是光呼吸中不可缺少的加氧酶. ）组装中，过剩的小亚基被迅速降解 （t1/2=210min）。在缺叶绿素和Cu2+时，叶绿素a/b结合蛋 白和质蓝素也迅速降解。1.2.4 蛋白质前体分子的水解裂解加工 许多蛋白质是以前体分子形式合成的，须经有限的水 解，切去多余的残基或片段，才能生成成熟的蛋白分子。 如酶原激活，凝血酶原和纤维蛋白原的激活，信号肽的切 除，抗原呈递和转录因子NF-B的激活等。1.2.5 清除反常蛋白质以免其累积到对细胞有害的水 平 基因突变、生物合成误差、自发变性、自由基损伤、环境扰 乱、病理状