第四章 DNA的生物合成DNA复制的特点1 1、半保留复制、半保留复制2 2、复制的起始，方向与速度复制的起始，方向与速度3 3、半不连续复制半不连续复制4 4、DNADNA聚合酶催化，多种蛋白质参与聚合酶催化，多种蛋白质参与一、 半保留复制 P514v半保留复制DNA在复制时，以亲代DNA的每一条链为模板，按碱基互补原则，分别合成新链，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA链。三种可能的三种可能的DNADNA复制机制复制机制实验证据Meselson和Stahl实验亲代DNA 15N标记新合成DNA 14N标记独立完成复制的功能单位称为复制子(replicon) 。DNA复制的起始，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，RNA引物的序列与模板DNA的碱基顺序相配对。DNA复制大多为双向等速复制。二、 复制的起始，方向与速度vDNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始位点(origin) 。l复制起始位点序列特征：富含AT，具有复制起始蛋白识别的区域。 细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列原核与真核复制子原核复制子真核复制子oriterA B CA. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter)DNA的双向复制示意图三、 半不连续复制lDNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模 板DNA链的前进方向必须是35。l复制时，1条链的前进方向与复制叉打开方向是一致的 ，可连续合成，称为先导链(leading strand)，另一条链的前进方向与复制叉打开方向相反，不能连续复制 ，称为滞后链(lagging strand)。所以DNA的复制是半不连续复制。l滞后链的复制过程: 先以片段的形式合成冈崎片段，多个冈崎片段再连接成完整的链。DNA的半不连续复制35353535复制方向先导链 (leading strand)滞后链 (lagging strand)35活性：1. 53 的聚合酶活性聚合反应： 底物dNTP2. 核酸外切酶活性（一）、DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA pol）四、四、DNADNA聚合酶催化，多种蛋白质参与聚合酶催化，多种蛋白质参与5 A G C T T C A G G A T A 3| | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?切除突变的 DNA片段与冈崎片段中的引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。DNA聚合酶的核酸外切酶活性 l在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ）。参与DNA复制的主要是pol 和pol 。DNA聚合酶的种类原核生物中的三种DNA聚合酶 pol pol pol 53聚合酶活性+53外切酶活性+-35外切酶活性+生理功能填补缺口 修复损伤 校正错误主要起 修复作 用复制先导链与 冈崎片段 校正错误lpol 可被特异的 蛋白酶水解为两 个片段，其中的 大片段保留了两 种酶活性,即53 聚合酶和35外 切酶活性，通常 被称为Klenow 片 段。 Klenow片段的分子结构真核生物的DNA聚合酶DNA-pol分子量(kD)16.54.014.012.525.553聚合酶活性+?+35外切酶活性-+生理功能起始引 发 引物酶 活性低保真 度复制线粒体 DNA复 制延长子 代链的 主要酶 ,解螺 旋酶活 性填补缺 口,切除 修复,重 组l单链DNA结合蛋白是一些能够与单链DNA结合的蛋白质，以四聚体形式与单链DNA结合，起保持单链的存在的作用。（二）、单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）l解链酶，又称解旋酶，解螺旋酶 ，是用于解开DNA双链的酶蛋白。l延模板链移动，每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。（三）、解链酶（helicase）拓扑异构酶的作用特点能水解连接磷酸二酯键拓扑异构酶拓扑异构酶分 类能够松解DNA超螺旋结构的酶。（四）、DNA拓扑异构酶 ( topoisomerase)拓扑异 构酶切断DNA双链中一股链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异 构酶切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制 lDNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。滞后链冈崎片段的连接。（五）、DNA连接酶第三节 DNA的复制的过程一、一、 复制的起始复制的起始二、二、 复制的延长复制的延长三、三、 复制的终止复制的终止四、四、 环状环状DNADNA的复制的复制五五、 端粒与端粒酶端粒与端粒酶 lDNA复制的起始由两步构成。1解旋解链，形成复制叉：A. DnaA蛋白识别复制起始序列，由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA双螺旋结构解开，形成两条单链DNA。B. 单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合 在两条单链DNA上，形成复制叉。一、复制的起始2引发体组装和引物合成：A. 由解链酶(DnaB蛋白) 等6个蛋白装配成引发前体，并与引发酶(DnaG蛋白) 形成引发体；B. 在引发酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段作为引物，从而获得3端自由羟基（3-OH）。 Dna ADna B Dna CDNA拓扑异构酶引物 酶SSB3535含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和 DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 引发体的组装形成二、复制的延长 l复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合形成子代DNA链。其化学本质是将dNMP逐个通过磷酸二酯键添加到子链3 末端羟基上。 l在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。DNA延伸过程简图三、复制的终止 l在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；lRNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（一）去除引物，填补缺口：l在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。 （二）连接冈崎片段：555RNA酶OH P5DNA-pol dNTP 5 5PATPADP+Pi 5 5DNA连接酶随从链上不连续性片段的连接四、环状DNA的复制过程 l环状DNA复制有多种形式，比较常见的为复制、滚环复制和D环复制。l复制是通过Colin实验发现的。其特点是：复制起始后双向复制，得到2个环状子代DNA分子。Colin实验过程l滚环复制特点（1）不需RNA引物（2）只有一个复制叉，单向复制（3）形成多联体（concatemer ）（4）一次起始可以合成多个子代DNA，效率高l采用滚环复制的DNA，大多为噬菌体DNA。35553335滚环复制的过程3-OH5-P5533 5lD环复制(D-loop replication) ：是线粒体DNA 的复制形式，其特点是：单向复制，两条链合成不对称，形成一个双链环状分子与一个部分单链环。D环复制的过程l链状DNA的末端问题：线状DNA，复制完成切去引物后，会产生5末端缺失。五、端粒与端粒酶 5353l端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。功能 维持染色体的稳定性 保证DNA复制的完整性端粒的结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基 的短 序列。TTTTGGGGTTTTGGGGl线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。53355335端粒酶(telomerase)端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA（端粒酶RNA）为模板，通过反转录酶（端粒酶反转录酶）催化反转录反应对末端DNA链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的爬行模型（动画演示）反转录酶和反转录现象的发现 理论意义：RNA兼有遗传信息传代与表达功能。 应用意义：可人工合成cDNA及构建cDNA文库。反转录酶与反转录现象TeminBaltimore反转录过程RNA 模板 反转录酶DNA-RNA 杂化双链 RNA酶单链DNA反转录酶双链DNA第三节 DNA的突变一、基因突变一、基因突变的特征与意义的特征与意义二、二、基因突变的类别基因突变的类别三三、引起基因突变的原因引起基因突变的原因一、基因突变的特征与意义可以通过复制而遗传的永久性DNA结构的改变，称为基因突变（ Gene Mutation）。其特征是：1. 基因突变在生物界中是普遍存在的；2. 基因突变发生频率很低；3. 基因突变是随机发生的；4. 基因突变是不定向的，有可逆性。基因突变的后果与意义1. 突变导致表型的改变，严重的导致死亡（致死型突变，条件致死型突变）；2. 突变是很多疾病的发病基础；3. 大多数基因突变不产生个体的变化；4. 突变是进化的分子基础。二、基因突变的类型DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。多个碱基的改变称多点突变，也称复突变（multiple mutation)点突变的类型发生在同型碱基之间。转换发生在异型碱基之间。颠换1. 碱基替换: 一个碱基替换为另一个碱基镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链CTC GAG基因血红蛋白-亚基的点突变2. 碱基缺失：一个碱基从DNA大分子上消失。3. 碱基插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸 链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造 成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或插入都可导致框移突变。谷 酪 蛋 丝5 G C A G T A C A T G T C 丙 缬 组 缬正常5 G A G T A C A T G T C 缺失C缺失引起的框移突变复突变的类型插入 增加一段顺序。 缺失 减少一段顺序。 复突变 倒位 一段碱基顺序发生颠倒。 易位 一段碱基顺序的位置发生改变。 重排 一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。 重排 DNA分子内较大片段的交换