人类疾病动物模型广东省实验动物监测所1定义n人类疾病的动物模型 （Animal Model of Human Disease）是 指在生物医学科学研 究中所建立的具有人 类疾病模拟性表现的 动物实验对象和材料 。n动物模型是一只只动 物的集合。n应用：疾病机理研究 ；药效评价等。 2n疾病动物模型是从整体上进行评价，什么 是整体的正常或健康状态？n疾病动物模型工作的对象是异常的、病态 的或反常的，不是正常的或健康的动物。 动物模型研究首先要明确动物疾病的论断 。n模式动物：经常使用的、确知有用的、已 标准化的，用于疾病模型研究的动物。3研究意义n避免人体接受实验的风险；n便于实验材料的获取与比较；n简化实验操作；n提供发病率较低的疾病材料；n有助于更全面地认识某些疾病的性质。4n 以模拟人类疾病表现或机理为目的n 实验动物为载体n 使用特定的方式进行模型研制n 以方便实用有效可控为前提疾病动物模型的特点5n怎么去评价一个动物模型的成功建立？相似性一致性实用性可控性可重复性易行性可靠性经济性6人类疾病动物模型的类型n完全疾病表现的模型，最理想的疾病模型 ；n部分疾病表现的模型；n同类疾病的模型或参比疾病的模型；n疾病病理的模型；n病原免疫的模型；n基因工程疾病的模型；n复合疾病的模型；n群体动物的模型；n特殊疾病的模型；7疾病动物模型研究、应用规范n动物规范要求，实验动物、经济动物和野 生动物。n病原规范化要求，标准株、模式株、代表 株。n研究规范要求，接种方式、模型指标等。n模型研制途径要求。n剂量要求，疾病的最大化原则。n模型指标要求，临床研究、疾病病原学要 求，免疫学要求，病理生理。n药物疫苗研究规范。8疾病动物模型分类n动物模型分类方式较多，产生原因、系统 、病理、中医药体系等。n按产生原因分类：自发性动物模型和诱发 性动物模型。9自发性疾病动物模型n动物自然发生的疾病或由于基因突变的异 常表现通过遗传育种定向培育保留下来的 动物模型。10n优点：人为因素少，更接近人类自然发病 ，应用价值高，广泛应用于遗传性疾病、 免疫缺陷病、肿瘤等。n缺点：发现的种类有限，发病的因素复杂 ，发病的条件要求高，可复制性差，尚不 能普遍应用。11nT淋巴细胞功能缺 陷的动物（裸小鼠、裸大 鼠）nB淋巴细胞功能异 常的动物（CBA/N小鼠）n严重联合免疫缺陷 动物（SCID小鼠和 SCID-hu小鼠）12自发性肿瘤动物模型n C3H 乳腺癌（100%），受多种因素的诱导和调 节，包括病毒、化学致癌物、辐射、激素、遗 传背景、饲料和免疫状况等。其中病毒是最重 要的因素，小鼠肿瘤病毒MMTV/S（Bittner病毒 ），高度致癌性，主要作用于C3H、DBA等品系 小鼠，潜伏期一般1年。n自发性乳腺癌模型应用，选用高发病率的C3H小 鼠DBA/2小鼠，获得CD2F1小鼠，出生后10.5 月后出现乳腺肿瘤，而后存活20-35天死亡。 1314诱发性疾病动物模型n诱发性动物模型：应用各种物理、化学、 生物或复合致病 因素作用于动物后认为诱 发动物产生某些类似人类疾病的模型。15n优点：短时间内复制出大量疾病模型，实 验条件易控制，重复性好。n缺点：与自然发生的人类疾病在某些方面 存在一定差异，存在一定的局限性。16诱发性动物模型制作原则n动物选择原则，实验动物、经济动物、野 生动物；n病原选择原则，标准株、模式株、代表株 等。n疾病最大化原则，最大程度拟疾病临床表 现、疾病过程、病理生理特征、免疫特征 等。n标准化、规范化原则，可控性、可重复性 。n生物安全原则。17感染性疾病动物模型流感病毒感染动物模型n小鼠感染模型；n雪貂感染模型；n猴感染模型；n其它模型，猪、兔感染模型。 18品系（ ICR Swiss、Swiss -Webster 和 BALB/c ）性别无差异 ，常用雌性年龄，刚 断奶小鼠 易感，适 应株5-8周 小鼠毒株，鼠适应株 A/ PR/ 8/ 34 ( H1N1) 和A/ FM/ 1/ 47 ( H1N1) 鼻腔接种，气 溶胶接种临床症状， 48-96 小时出现症状，呼 吸频率加快，体温 下降肺部实变，肺组织重 量 ，动脉血氧饱和 度 ，肺组织匀浆中 进行病毒检测19最易感动物 ，病毒不需 要适应鼻孔接种临床症状，体温升高、流涕、张口呼 吸、活动迟缓病毒滴度测定 、病理诊断等20n猴、猿等灵长类动物与人具有相似的生理 、生化特征，其作为实验动物有着其它动 物不可替代的优势。n但由于动物珍贵，实验成本高及受伦理学 方面的限制，很少用于流感的研究。21实验动物品系影响u实验动物 不同品系 小鼠对 H5N1禽 流感病毒 易感性不 同。品 系ICR 小 鼠BABL/c小 鼠NIH 小鼠C57 小鼠KM 小 鼠 死 亡 率5070%40251022不同品系小鼠感染体温变化23不同品系小鼠感染肺病理变化u肺脏充血和 水肿；器官和支气管 内有血性分 泌物；粘膜下层有灶 性出血、水 肿和细胞浸 润；肺泡腔内含有 纤维蛋白和 渗出液，呈 现浆液性出 血性支气管 肺炎。正常小鼠BABL/C小鼠ICR小鼠昆明小鼠24不同日龄小鼠易感性u刚离乳至性 成熟之前的 小鼠比较敏 感，死亡率 高于其它组 的小鼠。 组别体重死亡率刚离乳组11-13g16.7% 离乳至性 成熟组 14-16g 50% 16-18g 50% 性成熟组18-20g 30% 25病毒株影响uA/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)，经过对其 HA，NA，NP，NS，PA，PB1，PB2，M蛋白的测序 分析，该病毒HA、NA分别与2001年、2003年福建 分离的猪流感病毒的同源性较高。u经鸡胚尿囊液增殖，鸡胚半数致死量（EID50） 为107.31/0.1 mL，鼻腔接种小鼠。u不需要小鼠适应。u禽流感感染小鼠早期典型毒株HK_483_97（小鼠 急性死亡，肺外器官感染）, HK_486_97（小鼠 不死亡）, HK_156_97（介于两者之间）；我们 使用的毒株对小鼠的毒力类似于HK_156_97株。26接种途径u鼻腔接种，禽流感模型常用的接种方法；u静脉接种，能引起死亡，死亡率低于鼻腔接种 ，肺能形成弥散性肺泡损伤及渗出性炎症，不 能检测到病毒载量。u脑内接种，不引起动物死亡，注射部位出现小 胶质细胞浸润。静脉腔接种肺部2d病变 脑内接种第3天脑 27模型指标u临床症状： 接毒组小鼠 出现呼吸急 促，饮食量 下降，精神 不振，弓背 、蜷缩、竖 毛、颤抖， 反应性差， 活动减少， 爱扎堆。极度衰竭小鼠 潜伏期的小鼠恢复后的小鼠恢复期的小鼠 28uH5N1感染小鼠的死亡分布，感染第2d出现死亡 ，第3-7d死亡高峰，死亡率达86.7%，ST50在 5.25d。 29u病理特征：感染小鼠的临床特征出现早期、进展 期和死亡高峰期和恢复期，表现呼吸困难，甚至 死亡；组织病理变化显示弥散性肺泡损伤及渗出 性炎症。感染第2天，肺泡出血感染第2天，肺间质增生 ，肺泡隔增宽，肺泡萎缩感染第8天，大量纤维素 性及浆液性渗出，有透明 膜形成 30小鼠感染H5N1禽流感病毒与人感染的临床特征比较潜伏期临床特征症状与体征病程人一般为1- 3天， 通常 在7天 之内发病年龄以儿 童和青壮 年为主； 女性病人 略多于男 性；病死 率高发热；全身中毒症状（ 肌肉酸痛，寒战， 乏力，头痛）；呼 吸困难；消化道症 状；神经系统表现 ；多器官功能衰竭 。早期（1-4天）、 进展期（5-21 天）和恢复期 （22天后）小鼠0-1天对离乳后，性 成熟之前 小鼠更易 感 体温降低；呼吸困难； 活动减少；食欲下 降；聚堆，立毛。早期（0-1天）； 进展期（2-7天 ），死亡高峰 期（3-5天）； 恢复期（8-14 天）31脏器病变类别BALB/c小鼠人肺炎症细胞浸润肺泡中大量巨噬细胞和少量中性 粒细胞浸润，肺间质和终末细 支气管有淋巴细胞浸润，感染 晚期，肺组织中有浆细胞产生 。肺泡中主要是巨噬细胞，间质中 主要是T淋巴细胞，肺中可见 散在的具噬红细胞活性的组织 细胞，感染晚期偶见浆细胞；充血、出血、 水肿间质、肺泡、终末细支气管出血 ，血管、终末细支气管周结缔 组织水肿。肺水肿。增生肺间质增生，肺泡隔轻度增宽， 肺泡萎缩。肺泡型细胞增生，早期肺泡隔 轻度增宽；中期间质反应性纤 维母细胞增生；晚期呈纤维化 改变，部分肺泡萎缩或代偿性 气肿。 渗出肺泡中纤维素性及浆液性渗出， 有透明膜形成。肺泡中纤维素性渗出。细胞坏死脱落终末细支气管的上皮肿胀、脱落 ，脱落的上皮细胞进入肺泡中 。上皮细胞脱落，并进入肺泡腔。其他肺泡扩张；胸膜炎；肺泡上皮细 胞和白细胞凋亡。小鼠感染H5N1禽流感病毒与人感染病理比较32H5N1病毒感染小鼠体内病毒检测uRT-PCR检测接毒小鼠（BALB/c）肺病毒在第1天至第九 天均能检出，心、肝、脾、肾、脑、胸腺均未能检出。33H5N1病毒感染小鼠组织中的病毒的增殖结果 Replication of virus in infected H5N1 mouse tissuesRouteVirus titera（log10 EID50/g）Lung 肺Heart 心Liver 肝Spleen 脾Kidney 肾Brain 脑Intranasal （100 L ）2.78a：The tissues were collected on day 3; -: H5N1 virus was not detected。34感染小鼠抗体变化趋势35H5N1病毒感染小鼠的T淋巴细胞的变化u血液中T细胞下降明显，有统计学意义，在接毒后的第4天下降 到最低值：CD3+T细胞占淋巴细胞的百分比由59.6下降到44.4 ；CD4+T细胞占淋巴细胞的百分比由46.5下降到35.4；CD8+T细胞占淋巴细胞的百分比由14下降到9.4。 36感染小鼠细胞因子变化u非特异性免疫因子IL-18 出现明显上升，感染第5 天达到最高3133.5 pg/mL ；IL-10出现明显上升， TNF-出现缓慢下降趋势 。37u特异性细胞因子： IFN-感染前期出 现缓慢下降、IL-2 未见明显变化； IL-4感染后期明显 上升；38模型优缺点u能够引起感染动物死亡，ST50在5.25d， 显示与人相似的病理特征，有效应用于抗 禽流感药物的研究。u体温下降，不能形成肺外器官感染，不能 观察到肺泡II细胞的增生。39恒河猴感染H5N1流感病毒u通过“环甲膜穿刺术”经气管注射7ml病 毒液/只；u感染猴不出现死亡；u采用不同时间段检查猴感染状况，30h， 80h，240h，336h。40模型指标u体温变化：染毒后第12h出现上升，最高可达 41.2，第36h后体温在正常水平范围波动。41u呼吸频率：变化染毒后，第12h呼吸频率出现上 升，36h呼吸频率达最高峰（120次/min），随后 逐渐回落，第84h后在正常水平范围波动。42病理变化感染30h，2/3的左 肺叶及右肺门处可 见暗红色肝样变区 ，水肿渗出；显微镜下，肺组织 实变严重，大量红 细胞和炎性细胞侵 润及纤维素渗出43染毒后第72h最为严重， 水肿渗出严重，左肺叶大 部分呈暗红色肝样变，病 变区质实，切面呈红褐色 ，可见较多粉红色泡沫状 液体渗出；双肺的胸膜均 光滑，胸腔内无明显积液 ，肺动脉分支内未见血栓显微镜观察，肺组织 实变严重，可见大量 红细胞和炎性细胞侵 润及纤维素渗出 44感染后第240h，肺组 织病变区缩小，大约 1/3的左肺叶及右肺 门处可见暗红色肝样 变区，水肿渗出减轻 。显微镜观察，肺泡 壁增厚， 型肺泡 上皮增生。45电镜观察u在染毒后第72h，在肺泡腔肺泡上皮细胞和内皮细胞 间，可见堆集的病毒样颗粒46各组织病毒的检测uRT-PCR检测病毒，在第1天肺与支气管中检出，第3 天肺中检出，特异性扩增条带237bp