植物组织培养学Plant tissue culture第一章 植物组织培养简介定义：离体（in vitro)条件下利用人 工培养条件在无菌情况下培养、生长 、发育再生出完整植株的过程。n 植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。 发展简史n 1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。应用领域1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物-紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/（gFWd）的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。植物组织培养的分类n外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取 下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官 等。n广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养 （organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem culture) 、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养(protoplast culture)n愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成 的一团无序生长状态的薄壁细胞。植物组织培养的理论基础 植物细胞的全能性n植物细胞的全能性（totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具 有发育成完整植物体的潜在能力。n原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所 特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体 所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每 一个活细胞都应该具有全能性。差异：差异：（1 1） 受精卵的全能性受精卵的全能性最高最高 （2 2） 受精卵分受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低低。潜在全能性的原因：潜在全能性的原因：基因表达的选择性基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。下实现的这一过程，就是植物组织培养。植物细胞全能性的表达n 脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑 制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性 。n 再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种 不同细胞类型的能力。离体的植物 器官、组织 、细胞脱分化愈 伤 组 织再分化根芽植 物 体植物组织培养过程植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、 空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。植物组织培养特点植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往2030d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 植物组织培养特点n培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 n生长周期短，繁殖率高管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。物力及田间种植所需要的土地。 第二章 组织培养实验技术第一节 实 验 室在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需 要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地 制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室 的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目 的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在 设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计， 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件 ，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控 制温度、光照、湿度等培养条件。1、 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。2、 实验室组成：化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室。n 化学实验室（准备室）：完成所使用的各种 药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装 等。主要设备： 药品柜、防尘橱（放置培养容器） 、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培 养基配制用玻璃仪器.n 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥 、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥 灭菌器（如烘箱）等。n无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料 的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继 代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌 操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解 剖刀、接种针）等。对接种室的要求如下：接种室宜小不宜大，一般接种室宜小不宜大，一般7 78 8平米，要求地面、天花平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。动门，以减少开关门时的空气扰动。 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1 12 2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。界空气对流。 接种室应设有缓冲问，面积接种室应设有缓冲问，面积1m21m2为宜。进入无菌操作为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。n培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高17m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长I3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在培养室最重要的因子是温度，一般保持在20202727左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%70% 80%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可为好，可安装加湿器。控制光照时间可 安装定时开关钟，一般需要每天光照安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h10-16h， 也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照 条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培 实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要 能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接 受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可 用灯光作补充。用灯光作补充。主要设备：主要设备：培养架（控温控光控湿）培养架（控温控光控湿）、摇床、摇床 、培养箱、紫外光源等。、培养箱、紫外光源等。n细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。n其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。n。准备室缓冲间(过渡室 )接种室(外设缓冲间)培养室仪 器 设 备高压灭菌锅手提式灭菌锅超净工作台第二节 植物组织培养的培养条件一、营养条件培养基(culture medium) 培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。 培养基的种类n 培养