对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白 VP28基因的克隆及纯化 07100 食品专业 指导老师： 2011.5.08一、研究背景二、研究意义与目的三、实验设备四、毕业设计概述与成果展示五、问答时间六、致谢研究背景u世界对虾养殖业兴起于20世纪70年代，并在80年代得到飞速发展 l我国沿海地区经济的重要产业之一就是中国对虾(Penaeus chinensis) 的养殖, 并且养殖产量在 1993 年以前连续几年位居世界前列u对虾养殖业发展快速，伴随养殖环境恶化、种质退化和种质资源破坏、非传染性疾病以及传染性疾病等一系列问题逐步滋增，严重制约着对虾养殖业的进一步发展。NEXT研究背景u对虾病毒病，已成为阻碍对虾养殖业发展的主要因素 l白斑综合症病毒white spots syndrome virus 简称 WSSV，是1993年来引发我国大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病因 ；l中美学者徐洵等和荷兰学者van Hulten 等先后完成了 WSSV 的基因组全序列的测定 ；l近年来研究的热点问题就是对虾免疫学，目前对虾的免疫研究主要集中在抗菌方面，而有关抗病毒作用的研究较少，而病害控制除了病原以外，宿主本身的抗病能力也是一个重要因素。 BACK研究意义与目的u有研究以证明囊膜蛋白Vp28与对虾白斑综合征系统感染有关。对探索WSSV病毒膜蛋白在感染过程中的作用，应该从病毒和宿主两方面入手，为建立有效的防治方法提供科学依据。u本实验着重研究与对虾WSSV病毒的感染密切相关的主要囊膜蛋白Vp28，对此基因进行克隆与表达，为探讨WSSV病毒感染的分子机制提供良好的基础材料。BACK毕业设计概述与成果展示p毕业设计分三大部分：基因重组基因表达蛋白质纯化BACK基因重组PCR扩增Vp28基因(图3-1) 将含有pGEX-4T-2的大肠杆菌接种 琼脂粉凝胶电泳 到5l LB培养液中，37中摇培过夜割取目的条带 按试剂盒提取质粒，最后溶于30lddH2O中胶回收，溶于30lddH2O中 取3l电泳，确定质粒浓度取3l电泳，确定目的基因浓度 取适量质粒双酶切（同酶）取适量目的基因质粒双酶切 酶切后的质粒电泳酶切产物琼脂电泳 割取目的条带 割取目的条带 胶回收，最后溶于25 lddH2O胶回收，溶于25 lddH2O中 取3 l电泳，确定经酶切质粒浓度取3l电泳，确定经酶切目的基因浓度根据经酶切基因浓度：经酶切质粒浓度=（510）：1比例连接（16 过夜）转化涂布于平板，37 过夜，次日(图3-2)筛选阳性菌落，进行菌落PCRBACK基因表达p菌落PCR p筛选阳性菌株，阴性菌株排除p挑取23个阳性菌株，37摇床过夜培养p取1.5ml菌液提取质粒，溶于30lddH2O中 p取15l做双酶切鉴定，如图可确认为阳性菌p取1.5ml阳性菌液送去测序p另外取5l菌液接种到5ml培养基中， 37摇培过夜 p取200l菌液接种到5ml培养基中，37 摇培到OD 1.0p先吸取1ml菌液到EP管中，剩下的加入IPTG至终浓度0.25mM续培46hp收集菌体，加入1PBS 300l超声破碎，10,000rpm离心5min，取上清100l，加入蛋白Loading Buffer 40l(已配10:1)；沉淀用100l 1PBS溶解同样加入已配蛋白Loading Buffer 40l，热水煮5min, 10,000rpm离心5min,取上清10l电泳BACK蛋白质纯化q诱导条件的确定q蛋白质纯化（见图3-7）根据上图实验结论，应该从上清中纯化蛋白管号 变量温度（ ） 时间(h) IPTG终浓终浓(0.25 mmolL) A （见图3-5）18240.25 B （见图3-6）3720.25 C （见图3-6）3740.25BACK实验设备PCR仪； 电泳仪； 脱色摇床； 净化工作台； 生化培养箱； 暗箱紫外分析仪； 恒温摇床培养箱； 超声波细胞粉碎机； 电脑型烧烤微波炉； 各种量程微枪注射器； 贝克曼茨地式冷冻离心机； Eppendorf Centrifuge 5415D离心机等。BACK实验成果Vp28基因的克隆（一）Vp28基因的PCR扩扩增结结果Vp28基因的PCR产物经电泳后，在约650bp处可清楚地观察到DNA条带，大小和Vp28基因一致，结果见图3-1。M 1 2 3 4 5图3-1 Vp28基因的PCR产物电泳图M：DNA Mark； 1：对照组Vp28基因的PCR产物； 25：实验组Vp28基因的PCR产物 BACK实验成果重组质粒菌落培养结果（二）重组质组质 粒菌落培养结结果 Vp28基因的PCR产物与质粒4T-2载体均经NotI和SmaI双酶切后，连接、转化至重组大肠杆菌中， 进行培养。所培养菌落见图3-2。图3-2 重组质粒重组大肠杆菌菌 落培养图BACK实验成果重组大肠杆菌菌落的PCR扩增结果（三）重组组大肠肠杆菌菌落的PCR扩扩增结结果重组质粒所培养的重组大肠杆菌PCR扩增电泳的结果见图3-3。如图，在630bp左右处可在28孔中清晰 看到所培养菌落的DNA条带，1孔为阴性对照，无目的基因条带，说明所挑选的重组大肠杆菌菌落都为阳性 菌落，根据引物二聚体的条带亮度选择2、4、6三个阳性菌落接种过夜培养。M 1 2 3 4 5 6 7 8 图3-3 菌落PCR产物电泳图M：DNA Mark； 1：阴性对照组； 28：重组大肠杆菌的PCR产物BACK实验成果重组质粒酶切鉴定结果（四）重组质组质 粒酶切鉴鉴定结结果从pGEX-4T-2转化平板上挑取若干克隆所得质粒后，经NotI和SmaI联合酶切联，酶切产物 电泳图见图 3-4。 M 1 2 3 4 5 6 7图3-4 重组质粒酶切电泳图M：DNA Mark； 1、3、5：未酶切菌种pGEX-4T-2质粒；2、4、6：重组表达载体4T-2质粒双酶切； 7：目的基因回收条带BACK实验成果诱导条件的确定在18下，以IPTG终浓度为0.25 mmolL的诱导条件诱导表达蛋白的电泳胶结果观察，选 择 确定最佳的诱导条件。M 1 2 3 4 5 6图3-5 18，24h 诱导结果电泳图M：蛋白质Marker; 1：未诱导 4T-2菌；2：已诱导 4T-2菌；3：未诱导 重组菌；4：已诱导 重组菌；5：18 5ul 250mM/mlIPTG 24h诱导 上清； 6：18 5ul 250mM/mlIPTG 24h诱导 沉淀BACK90.1KDa66.2KDa43.0KDa实验成果诱导条件的确定图3-6 37，2h和4h 诱导结果电泳图M：蛋白质Marker； 1：未诱导4T-2菌；2：已诱导4T-2菌； 3：未诱导重组菌； 4：已诱导重组菌； 5：37 5ul 250mM/ml IPTG 2h诱导上清； 6：37 5ul 250mM/ml IPTG 2h诱导沉淀； 7：37 5ul 250mM/ml IPTG 4h诱导上清； 8：37 5ul 250mM/ml IPTG 4h诱导沉淀 M 1 2 3 4 5 6 7 8BACK90.1KDa66.2KDa43.0KDa实验成果诱导条件的确定（六）纯纯化蛋白质质的电电泳鉴鉴定按步骤（十一，3、）将表达产物裂解上清液，超声波表达产物上清，沉淀，电泳，经过染色， 脱色， VP28在55Kda处有一明显的表达带，如下图3-6所示，与预期的目的蛋白带大小一致，重组 质粒中VP28基因获得表达。M 1 2 3 4 5 6 7 8图3-7 18，24h诱导结果与纯化的Vp28蛋白电泳图 M：蛋白质Marker; 1：未诱导 4T-2菌；2：已诱导 4T-2菌； 3：未诱导 重组菌； 4：已诱导 重组菌； 5：18 5ul 250mM/mlIPTG 24h诱导 上清； 6：18 5ul 250mM/mlIPTG 24h诱导 沉淀 7：纯化蛋白质第二管； 8：纯化蛋白质第三管BACKGST-Vp2890.1KDa66.2KDa43.0KDa问答时间_BACK感谢导师的悉心指导，还有在座各 位老师的提问与点评；感谢相互鼓励着 ，并一同完成毕业设计的同学们；最后 ，感谢一如既往支持我的家人们!致谢：BACK