第二章 蛋白质分子折叠机理 第一节、概述： 蛋白质折叠：protein folding 结构上：伸展unfolding 三维结构 功能上：无活性分子有活性的分 子 一、问题的提出： 1。伸展的蛋白质肽链如何折叠成有 特定的三维结构？ 2。无活性的蛋白分子如何折叠成有 生物功能的蛋白质分子？ 体外实验：30年前如何？设备条件 、技术路线、研究人员不多。 现在情况？已成为生物化学与分子 生物学研究的活跃的领域。主要原因：n对于研究生物大分子结构与功 能的关系有重要的学术价值。n由于蛋白质工程研究的需要n基因工程研究发展的需要n先进实验设备的应用，研究手 段的提高。 (1)、二维核磁共振技术的建 立，分辨率高的核磁共振仪的 改进和完善。(2)、DNA重组技术的应用为 蛋白质折叠的研究提供丰富的 研究对象。(3)、计算机的进步和应用第二节、蛋白质的变性与复性 一、蛋白质变性的基本概念： 1。引起蛋白质变性的因素：物理因素、化学因素 2。蛋白质变性表现：n物理性质的改变：n化学性质的改变：n生物学性质的改变： 变性作用： 天然蛋白质： 变性蛋白质： 蛋白质变性： 可逆变性： 不可逆变性：3。检测蛋白质变性的方法：n测定蛋白质的比活力n以天然蛋白质为对照，测定蛋 白质的物理性质的变化例如：旋光法旋光度圆二色性法椭圆度紫外差示光谱消光系 数粘度法特性粘度电泳法电泳迁移率n蛋白质化学性质的变化：例如：侧链基团的反应性被蛋白酶水解情况n蛋白质的抗原性n蛋白质的溶解度4。蛋白质变性研究简史 第一阶段：变性现象的观察，吴 宪1931年变性理论为代表 第二阶段：变性与蛋白质分子构 象的关系 第三阶段：分子构象的变化研究 X光晶体衍射二、各种变性因素对蛋白质构象 的影响 1。温度：热变性、可逆与不可 逆 2。pH： 3。有机溶剂：静电力、氢键、 疏水键n静电力：改变溶液的介电常数 、影响离子氛、影响蛋白质分 子和溶剂间的相互作用n氢键：能与蛋白质生成强氢键 的溶剂，不利于蛋白质分子内 部的氢键形成，而不能与蛋白 质生成强氢键的溶剂，有利于 蛋白质分子内部的氢键形成。n疏水键：疏水键是一种疏水侧 链为了避开水相而群集在一起 的一种相互作用力。有机溶剂 可以降低溶液的极性，破坏蛋 白质分子中的疏水键，导致蛋 白质构象的变化。 4。脲、胍等变性剂对蛋白质构 象的影响： 5。表面变性剂对蛋白质构象的 影响：长链的脂肪酸、SDS三、蛋白质变性后构象的变化： 吴宪1931年提出的变性理论：蛋 白质变性后，肽链由原来紧密 有序的构象变成松散无规的构 象。 1968年Tantord 把变性产物的构 象概括：n高浓度的脲、胍变性的蛋白质 ，呈无规卷曲的构象，若打开 二硫键，变成线状无规卷曲n热、酸碱变性的蛋白质，往往 保持部分紧密构象。n高浓度有机溶剂变性蛋白质的 螺旋度增大，不存在疏水区四、复性：Renaturation 概念：变性的蛋白质在除去变性 因素后，恢复到天然状态的构象 和生物活性的过程称为蛋白质的 复性作用。第三节：蛋白质的折叠：Folding 蛋白质折叠：探讨蛋白质由伸展 态(变性)经折叠或再折叠(复性) 成天然态的机理。 探讨蛋白质一级结构与高级结构 的关系： 杜雨苍：1961年、胰岛素A、B链 的拆开、再合并，二硫键形成。 体外化学合成胰岛素A、B链， 研究二硫键形成的情况Anfinsen 1961年：核糖核酸酶变 性与复性的情况4对二硫键 被还原后再氧化重组，可以折 叠到天然状态，恢复生物功能 。 一级结构与高级结构的关系： 形成高级结构的信息全部蕴藏于 一级结构之中。 一级结构含 有全部高级结构的折叠密码。 1979年：Privalov 提出蛋白质折 叠的 “二态模型” U(伸展态) N(天然态) 1989年Kuwajima 认为蛋白质折 叠是逐步发生的过程，但未捕 捉到中间态。 1992年Dobson 首次报道蛋白质 折叠的中间态，提出 “三态”模 型第四节、蛋白质体外折叠机理 ： 1。折叠步骤： 三态模型：认为蛋白质肽链从 伸展态(U)经过早期的变化进 入中间态(I)，然后再由中间态 过渡到最终的天然态。2。折叠过程的起始点： 蛋白质氨基酸侧链的形状、大 小的不同将影响到侧链在三维 结构中所在的位置和安排方式 ；侧链的极性的不同决定蛋白 质分子中氨基酸残基之间和蛋 白质与水之间的相互作用的性 质和强度。折叠起始点：n折叠起始于稳定二级结构的形成： 变性后部分残余的蛋白质二级结构 如某些扭曲、转角作为折叠的“种 子”，氨基酸肽链围绕它们形成较 稳定的紧密的区域，再进一步形成 稳定的二级结构。n折叠由疏水倒塌(hydrophobic collapse)开始：由于氨基酸侧链基 团的疏水作用引起链的倒塌，使得 疏水侧链集中藏于分子内部，极性 侧链露于表面与水接触。n折叠起始于共价键相互作用的形成 ：1988年 Oas & Kim (Nature 336,42): 牛胰胰蛋白酶抑制剂；合 成；肽链片断；P (16肽，No.43- 58, -螺旋), P ( 14肽 No.20-33, - 折叠)；圆二色性测定肽链的构象 完全伸展(还原态)；当30位和51位 的二硫键连接后，两条肽链形成稳 定的二级结构3。折叠中间态： Ptitsyn 研究牛的-乳清蛋白在 热变性、胍变性时，蛋白质 的物理性质的变化时，发现 存在着一种相对稳定的具有 三级结构的紧密球状物的中 间态，称为熔球态(melton- globule state)。熔球态的特征：n具有天然态的一级结构n在分子中二级结构含量较高 。n三级结构不完整。n熔球态热变性时没有温度跃 迁、紫外吸收变化不明显。 4折叠途径：Folding pathwayn伸展的肽链在折叠成天然态 的过程中，要尝试所有可能 的构象，直到形成其天然态 蛋白质的构象为止。？n蛋白质折叠沿着单一的限定 的途径进行，每个分子都按 着同样的限定顺序进入天然 态。？n蛋白质折叠沿着有限的多途 径进行，同一种蛋白质的不 同分子在折叠过程中可以沿 着不同途径达到同样的天然 态，形成天然态途径的选择 是有限的。总结： 体外蛋白质的折叠可能是： 或者始于疏水倒塌、或者 始于稳定二级结构的形成 、或者始于共价键的相互 作用如二硫键的形成。在 折叠早期阶段，可能这三 种方式联合起作用，接着 折叠反应可能沿着有限的 途径形成中间态(如熔球态) 。中间态的结构紧密、二 级结构含量较高，但缺乏 明显的三级结构。最后由 中间态进入天然态，此步 是蛋白质折叠的限速步骤 。 第五节、伴侣蛋白与肽链折叠： 1伴侣蛋白及其功能： 伴侣蛋白(chaperones) 分子伴侣 (molecular chaperones):辅助蛋白质多肽链在合成过程中 的正确折叠和寡聚蛋白的组装。 伴侣蛋白存在于细胞液、内质网 、线粒体、叶绿体和细胞核中 功能：n能专一与细胞中非天然构象的蛋 白质相互作用，与合成中的肽链 结合，介导各功能域或整个蛋白 质分子的正确折叠。n能与细胞液中合成的线粒体及叶 绿体蛋白质结合，使其肽链保持 伸展状态而被跨膜运转。n在应激状态下，能与非天然构 象的蛋白质结合，稳定其结构 ，防止蛋白质变性导致内部疏 水基团暴露而发生不可逆的凝 集。 2伴侣蛋白的分类：根据伴侣 蛋白的结构，分为几个家族； 1) Stress-70家族： 结构特点：分子量约70 kd，由 两个结构域组成，N-末端结构 域高度保守，具有腺苷三磷酸 酶ATPase 活性。C-末端结构 域保守性差。 Stress-70家族的热休克蛋白 Hsp70 在热休克中的作用，目 前研究较广泛。 功能：Stress-70家族蛋白能 识别和结合新合成的蛋白 质肽链，使之稳定，以防 止错误折叠和聚集。在蛋 白质合成结束，就被从 Stress-70蛋白上释放出来， 并折叠成天然态。从Stress- 70蛋白上释放结合的肽链 需要能量，是来自于Stress- 70蛋白结合的ATP的水解 。2) Chaperonin家族 Chaperonin家族蛋白广泛存 在于细胞中，在热休克、 细菌感染等都能引起该族 蛋白在细胞内增加。 结构特点：Chaperonin家族 蛋白有两种氨基酸顺序相 关的类型，大的叫 Chaperonin-60 (cpn-60) 亚 基分子量60kd，由17个相 同的亚基组成的；小的叫 Chaperonin-10 (cpn-10) 亚 基分子量10kd，由7个亚基 组成的。 作用：Chaperonin家族蛋白 的作用是促进与其结合的 蛋白质肽链的折叠或装配 成天然态，识别的位点不 是靶蛋白的氨基酸顺序或 天然态，而是它们的部分 折叠的非天然态，并提供 一个表面或工作台面，在 其上结合非天然态蛋白质 ，然后通过一系列ATP水 解，完成被结合的非天然 态蛋白质的正确折叠或装 配。 伴侣蛋白如何协助新生蛋白质 肽链正确折叠？ Stress-70蛋白的作用是结合、 位点合成的蛋白质肽链，维 持其处于部分的状态，一旦 合成完成，就将其释放。这 种被释放出来的部分折叠的 肽链立即被Chaperonin家族 蛋白所捕捉并催化它正确折 叠成天然态。一个合成的蛋 白质肽链，可能依赖于一个 或多个分子伴侣，或者不同 的分子伴侣按前后次序工作 ，最后导致其折叠成为有特 定的三维结构和生物功能的 蛋白质分子。3钙联接蛋白介导糖蛋白肽链的折叠 ： 糖蛋白合成在内质网上，肽链一 边合成、一边糖基化、一边折叠 。糖蛋白的正确折叠与能识别糖 基化状态的伴侣蛋白有关。这种 伴侣蛋白需要钙离子的结合才能 发挥其功能.称为钙联蛋白 (Calnexin)。 钙联蛋白的特征：属于I型膜蛋白 ，C-末端位于胞液，有磷酸化位 点，N-末端位于内质网腔中，能 与钙离子和靶蛋白结合，介导糖 蛋白正确折叠。未折叠或错误折 叠的肽链能被葡萄糖基化，含有 葡萄糖基的肽链能被钙联蛋白识 别和结合，葡萄糖基被切除，正 确折叠的肽链不会再被葡萄糖基 化，从而不能被钙联蛋白结合。 钙联蛋白的活力受到钙离子和磷 酸化的调节，钙联蛋白与靶蛋白 的结合需要ATP酶作用。 第六节、生物工程中的蛋白质 折叠： 一、包含体(inclusion bodies)生物工程成就就是要使外源基 因在大肠杆菌中成功克隆和 表达。那么表达产物蛋白 质是否具有生物活性是生物 工程中一个必要解决的问题 。 包含体：在大肠杆菌细胞内表 达的外源基因蛋白质是以“变 性”的无活性的蛋白质形式存 在、沉积于细胞内,这种无定 形的蛋白质聚体,它们不被如 何膜所包围,称为包含体.包 含体的形成实际上是蛋白质 折叠中中间态的“非专一性聚 集”。U I N伸展态 中间态 天然态A (包含体)二、包含体形成的机理：蛋白质生物合成翻译产物蛋白质折叠稳定构象 不稳定构象可溶性 可溶性 不溶 性稳定 降解 包含 体 三、形成包含体在生物工程 中的意义：n形成包含体，呈致密的颗 粒，不易溶解，易纯化。n包含体的形成，保护表达 产物不被蛋白质水解酶降 解。n包含体成分是正确表达的 肽链组成，用变性剂增溶 成为可溶性的伸展肽链， 然后在适当的条件下折叠 成天然有活性的蛋白质分 子，从而达到生物工程的 最终目的。 蛋白质结构与功能要求：n选择某种蛋白质或酶n理化性质n结构特点n功能n实际应用n分子生物学n研究进展或研究概况 格式：参考厦门大学学报包括：题目 3#,作者5#,单位专业学号5#、中文摘要小 5#、前言、正文、总结、参考文献/注明 引用编号、作者全、题目、期刊、年卷 页。均为5，标题加黑，大约4000 5000字、A4纸， 交稿时间：11月27日前。 交稿方式：Email