第13章 DNA的生物合成复制DNA Biosynthesis：Replication本章主要内容v 中心法则v DNA的半保留复制v 复制系统的特征v DNA复制的机制v DNA结构的完整性重点与难点：大肠杆菌 DNA复制的过程、真核 生物DNA复制特点、 DNA的损伤和修复。Watson and Crick， 1953人类科学发展历史上的伟大里程碑。中心法则揭示了遗传信息的传递方向。1958年F. Crick提出中心法则从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。Reverse transcription复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形 成一条与DNA链互补的RNA的过程。几个重要概念DNA的复制 (replication)复制亲代DNA子代DNA由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。 翻 译：以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA 顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。一、DNA的半保留复制由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。1. 概 念(semi-conservative replication)2. 半保留复制的实验证据1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术，证明了DNA是采取半保留的方式进行复制。15N DNA14N- 15N DNA14N DNA14N- 15N DNA亲代DNA分子第一代DNA分子第二代DNA分子3. 半保留复制的意义 使亲代DNA所含的信息以极高的准确度传递给子代DNA分子。 DNA通过复制和基因表达这两种主要功能，决定了生物的特性和类型并体 现了遗传过程的相对保守性。二、复制系统的特征nDNA的复制开始于一个特定的位点，称为复制起始点（原点，Ori）。在原核生物只有一个起始点，而在真核生物有多个起始点。n从原点开始将DNA链解开，在复制的部分同时进行解链与合成，形成一个分叉，称为复制叉（replication fork）。 两个起始点，两个复制叉 一个起始点，一个复制叉 双向复制：从一个起始点开始，沿两个相 反方向各生长出两条链，形成两个复制叉 。复制的方向：三、DNA复制的机制4 原核细胞DNA的复制4 真核细胞DNA的复制（一）原核细胞DNA的复制n DNA复制起始的酶类及蛋白n DNA聚合酶n RNA引物n DNA连接酶n DNA复制的过程1. DNA复制起始的酶类及蛋白解螺旋酶（Helicase)：在复制的起始点上解开双螺旋。n 解螺旋酶n 解螺旋酶 n Rep蛋白解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，出现超螺旋。 拓扑异构酶 (DNA topoisomerase)作用：解除由解链酶造成的拓扑张力，能够松解DNA超螺旋结构，兼具有内切酶和连接酶活力，能迅速使DNA链断开又接上。 拓扑异 构酶使DNA的一条链断裂和再连接，使DNA解链旋转不致打结DNA变为松弛状态，反应不需ATP。拓扑异 构酶有称旋转酶，DNA分子两条链断裂和再连接，通过切口使超螺旋 松弛，反应需要ATP 。 单链DNA结合蛋白 （single stranded DNA binding protein, SSB）稳定已经解开成两股的DNA单链，与解开的单链 DNA 结合，防止其重新配对形成双链 DNA 或被核酸酶降解。SSB的生理作用1. 稳定单链DNA，便于其作为模板复 制子代DNA；2. 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。2. DNA聚合酶n有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；n有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；n有从53 外切酶的活性，其作用是切除引物。DNA聚合酶 I ：用于切除引物RNA，并填补留下的空隙DNA聚合酶II：n活性弱, 作用与聚合酶III相似n5 3 聚合酶功能n3 5 外切酶活性，n无5 3 外切酶活性。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。DNA聚合酶III 主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能n由10种亚基组成。有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3 OH以3, 5磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi 。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5 3；n有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；n有53 外切酶活性。 以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）作底物 。三种聚合酶的共性: 反应需要接受模板的指导，可以利用DNA双链作为模板，亦可以单链DNA作为模板。N35 5 OOH PPP-O-CH2OH 反应需要有游离的3-羟基作为引物。聚合方向总是5 3。PPi5 A G C T T C A G G A T A 3| | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5外切酶活性 5 3外切酶活性（聚合酶I , III）?切除复制时合成的RNA引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 外切酶活性DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶不同种类亚类亚 基数目1710相对对分子质质量103 00088 000900 000 53核酸聚合酶活 性+35核酸外切酶活 性+53核酸外切酶活 性+-+聚合速度（核苷酸/ 分）1 0001200240015 00060 000持续续合成能力32001500500 000分子数/细细胞4001001020功能切除引物，修复修复复制3. RNA引物n所有的 DNA 聚合酶都要求一个有自由 3-OH 的引物来起始 DNA 的合成。这段 RNA 长 510 个核苷酸，由一种特异的 RNA 聚合酶合成，此酶称为引物酶（primerase）。n引物酶只有复制起始的一些蛋白质形成引发 体（primosome）才能催化引物合成。3535 解链方向35335先导链 (leading strand)随从链 (lagging strand)引物引物引物 DNA聚合酶校对复制中的错误核苷酸，导致在形成新的磷酸二酯键前检测前一个碱基是否正确，决定了不能从头合成。先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来标记是“暂时”的。当DNA开始聚合以后在以53核酸外切酶的功能切除，以脱氧苷酸代替。为何先合成RNA引物，然后切除？增加了复制的复杂性，但保证了复制的忠实性。4. DNA连接酶（DNA ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻 的DNA链连成完整的链。原核生物通过分解NAD 为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP。DNA连接酶的作用n DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。n在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。n是基因工程的重要工具酶之一。 复制的起始5. DNA复制过程由解螺旋酶解链，形成复制叉，SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶与上述因子、酶构成引发体，并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。 复制的延伸在DNA-pol III催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本 质是磷酸二酯键的不断生成。 5 3 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol复制叉起点复制叉延伸延伸起点前导链前导链后随链后随链 3535半不连续复制在DNA复制时，前导链是连续合成的，而后随链的合成是不连续的，这种复制 方式称为半不连续复制。前导链连续复制前导链（leading chain）：为连续合成，合成方向与解链方向一致。后随链不连续复制后随链的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从53 方向生成引物然后复制，为不连续合成，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。后随链的合成随从链冈崎片段：在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而后随链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。复 制 延 长 简 图 复制的终止n由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。n原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。n复制的起始点和终止点刚好把环DNA分为两个半圆，两个方向各进行180，同时在终止点汇合。最末端冈崎片断的 RNA引物切除后可 求助于另半圈DNA链向前延伸来填补1. 真核生物的双向复制真核生物染色体有多个起始点，是多复制子的复制。由一个起始点控制的复制DNA单位称为一个复制子 (replicon) ，复制子是独立完成复制的功能单位。 （二）真核细胞DNA的复制2. 真核生物的DNA聚合酶参与DNA 的修复线性DNA的末端复制的问题3. 端粒 (telomere) 的复制端粒: 是指真核生物染色体线性DNA分子末端结构部分，通常膨大成粒状。末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒的功能:n补偿RNA引物切除后造成的空缺，保证染色体复制的完整性。n 稳定染色体的末端结构。n 防止染色体间末端连接。端粒酶 (telomerase)含有RNA链的逆转录酶，能以RNA为模板合成端粒区的DNA片段。端粒酶的 爬行模型当端粒长度下降到某一临界值时，细胞终止分裂：衰老、死亡“多莉”的衰老 研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命 研究推测端粒酶与肿瘤的关系真核生物中DNA的复制特点n真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼 ，呈双向复制，多复制子。n冈崎片段长约200bp.n真核生物DNA复制速度比原核慢。n真核生物有多种DNA聚合酶。n真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止 染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成 链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。四、DNA结构的完整性1. DNA复制的忠实性至少依赖三种机制:n遵守严格的碱基配对规律n聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）n复制出错时有即时的校读功能2. DNA的损伤（DNA damage）个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段在DNA的构成、复制或表型功能上的异常变化，称为DNA损伤。也称为突变（Mutation）。引发损伤的因素:n环境中的理化因素，如指紫外线和各种辐射及许多化学诱变剂，常常导致DNA突变。如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。 突变的分子改变类型:点突变 (错配, mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion