第二节 多底物反应及其动力学一 反应机制的分类：(一) Cleland表示法的基本符号和概念：v底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示v产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示v游离酶：E、F、Gv抑制常数：KiA 、KiB ; KiP 、 KiQ v米氏常数：KmA、KmB; KmP 、 KmQ v抑制剂：I v修饰剂：X或Yv反应分子数: Uni(单) 、Bi(双)、 Ter(三) 、Quad(四)v酶反应中间物：分为两类(1) 稳态中间物：指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可 以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些Ser蛋白酶 在催化过程中形成的酰化酶中间物包括：共价结合的ES中间物；自由酶(2) 过渡态复合物：非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后 再解离出产物或底物。分为: 非中心复合物：酶未完全被底物饱和中心复合物： 酶已经完全被底物饱和，(EAB EPQ); (EA EP) (二) 反应机制的分类和命名(以双底物双产物反应为例）：1. 序列(sequential)反应机制: 酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双底 物双产物反应，必有酶-底物三元复合物形成。v 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为:(1) 有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi) ：A B P QE EA (EABEPQ) EQ Ev EA、EQ : 非中心复合物； (EAB EPQ) : 中心复合物v A：领先底物； B：随后底物例如：许多以NAD+或NADP+为辅酶的脱氢酶类，乳酸脱氢酶（LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)等NAD+ 苹果酸(MA) 草酰乙酸(OAA) NADHMA OAAE ENAD+ (ENAD+ E NADH) E NADH E v NAD+ / NADH 形成外底物对v机制：由于底物A与酶结合后改变了酶的构象，使原来隐蔽的B结合位点暴露， B才能结合上去。暗示：A与B可能结合在酶的不同部位。(2) Theorell- Chance (T-C 机制)：A B P QE EA EQ E第二个底物B结合及释放非常快，没有明显的三元复合 物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制 。例如：马肝醇脱氢酶：NAD+ 乙醇 乙醛 NADHE ENAD+ E NADH E(3)随机双双(random Bi Bi)：A B P QEA EQE （EABEPQ） EB A Q Pv 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。v少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激 酶: 肌酸 + ATP 磷酸肌酸+ ADPv机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态，两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。EBEP2 乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)：各种底物全部和酶结合以前 ，已经有一种或多种 底物放出，不形成三元复合物。A P B QE (EAFP) F (FBEQ) Ev属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素 酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制：Asp OAA AKG GluECHO (ECHOAsp ENH2 (ENH2AKG ECHO ENH2OAA) ECHOGlu) v总结：有序机制序列反应机制 T-C 机制随机机制乒乓反应机制二 King-Altman法速度方程图示法(一)Kappa表示法: E + A k1 EA 1 k-1 2Vf= k1 A E ; Vr= k-1 EAv Kappa()= 速度常数项 底物(产物)浓度项 正向反应的Kappa：12 =k1 A 逆向反应的Kappa：21 =k-1反应速度：Vf= 12 E ; Vr= 21 EA v 具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的流向有关(二)King-Altman 法步骤:(1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封 闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用n表 示。然后在各角之间连线上标出各步反应的。E + A k1 EA k2 EP k3 E + Pk-1 k-2 k-3E k1A EAk-1 k-3P k3 k2k-2EPE = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3PE k1A EAk-3P k3 k-1 k2 k-2 EP E :EA:EP:（2）画出King-Altman 图形，即：所有流向各种酶形式的n1线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上,并写出流向各种酶形式的乘积之和。k-1k3k-2k-1 k3k2k1Ak3k1Ak-2k-3P k-2k-3Pk-1k1Ak2k-3Pk2（3）速度方程推导: v 各种酶形式的浓度与其乘积之和成正比:E E ; EA EA; EP EP E0 = E + EA + EP E = EE0 E = （E）E0 EA = EAE0 EA=（EA）E0 EP = EPE0 EP=（EP）E0 V = k3 EP k-3 E P = (k3EP /k-3 PE/ )E0= (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0(k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P= num1A num2Pconst + coefA A + coefP P num1 : 分子中A项之前的系数乘以E 0 num2 : 分子中P项之前的系数乘以E0 const : 分母常数项coefA : 分母中A项之前的系数coefP : 分母中P项之前的系数E k1A EAk-3P k3 k-1 k2 k-2 EP (三) 注意: 矢量图数目的计算 : n-1线矢量图数目= m! (n-1)!(m-n+1)!n=角数; m=封闭环的线数 n=3; m=3; n-1线矢量图数目= 3! =3(3-1)!(3-3+1)! King- Altman 图形不包含封闭环形式：E1 E2 E3 E4 v n=4，m=5 n-1线（3线）图数目= 5！ =10个， (4-1)！(5-4+1)！ v 2个封闭环形式无效，应去除。共有8个有效的 King- Altman 图形 反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King- Altman 图形不存在。E + A k1 EA k2 EP k3 E + Pk-1 k-2此反应若没有k-3 线，则某些King-Altman 图形不 存在，反应速度中凡是含k-3 项 者不存在。K-3E : k-1 k-1 k3k3 k-2 k2 EA: k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2EP: k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3PE k1A EAk-3P k3 k-1 k2 k-2 EP V = k3 EP k-3 E P = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0(k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P= num1A num2Pconst + coefA A + coefP P 三 双底物反应动力学(一) 有序双双机制：1 方程的推导：E + A k1 EA + B k2 (EABEPQ) k3 EQ + Pk-1k-2 k-3 k-4 k4E + QE k1A EAk-1k4 k-4Q k-2 k2Bk-3PEQ (EABEPQ) k3v n=4, m=4, 则n-1线(3线)矢量图数目为4E : EA:EAB:EQ: k4 k1Ak-3Pk-1k1Ak-4Qk-4Qk-3Pk-3Pk2B k2Bk2Bk-3Pk-1k-1k-1k4 k4 k4 k3k3k2Bk